Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Sublytische Effekte von Suilysin auf Epithelzellen und deren Konsequenzen für die Invasion von Streptococcus suis

Neis, Christina

Streptococcus (S.) suis infections are a worldwide problem in pig breeding. Besides clinical diseases like meningitis, septicaemia, arthritis and bronchopneumonia asymptomatic carrier animals occur. S. suis is also a zoonotic agent which causes mainly meningitis and septicaemia in human. So far little is known about pathogenesis. Nevertheless, since the natural habitat of S. suis is the upper respiratory tract the penetration of the epithelial cell barrier most likely plays an important role in the initial phase of infection. The aim of this work was to characterise sublytic effects of suilysin (SLY) on the interaction of S. suis with epithelial cells. SLY belongs to the family of cholesterol-binding cytolysins. Besides pore forming these toxins also show further effects that already occur at sublytic concentrations and can contribute to the virulence of the bacteria. To analyse the sublytic effects of SLY sly-negative mutants were constructed using a serotype 2 wild type strain and its non-encapsulated mutant. These strains were characterised in their interaction with human epithelial HEp-2 cells. Additionally recombinant SLY (rSLY) was produced, SLY was heterologously expressed in Lactococcus lactis and a polyclonal rSLY rabbit antiserum was generated. After characterisation of hemolytic and cytotoxic properties of the mutants and rSLY, adherence and invasion rates of the S. suis strains were determined under sublytic conditions. It was shown that the sly-positive strains were more adherent and invasive than the sly-negative mutants. The wild type phenotype was restored by addition of rSLY to the sly-negative mutants. Adherence and invasion of other, non-invasive bacteria and internalisation of latex beads were also increased significantly after complementation with rSLY. This suggested that SLY is able to stimulate the cell leading to an increased uptake of bacteria or particles. By binding and depletion studies cholesterol was determined as cellular receptor of SLY. To characterise the mechanisms of SLY mediated invasion of S. suis into epithelial cells, experiments using inhibitors of the actin cytoskeleton and of different signal transduction pathways were performed. The results showed that SLY activates the actin cytoskeleton via Rho GTPases, in particular Rac. Additionally it was shown that SLY is able to induce the expression of IL-8 and MCP-1 and to activate the transcription factor NFκB. Finally, the ability of S. suis to translocate through a polarised layer of respiratory epithelial cells was examined by using human Calu-3 cells in a transwell system. S. suis was able to penetrate paracellularly an intact cell layer independent of the presence of SLY and capsule without destroying the cell layer. From these results we conclude that SLY is not a classical adhesin or invasin. However, SLY leads to an increased internalisation of S. suis most likely by activating the cell in multiple ways after binding to cell membrane cholesterol. Moreover, SLY may lead to an increased permeability of the epithelial cell barrier by activating proinflammatory cytokines thereby facilitating the entry of S. suis into deeper tissues. However, SLY does not seem to be essential for translocation of S. suis through an intact cellular layer.

Infektionen mit Streptococcus (S.) suis sind ein weltweites Problem in der Schweinehaltung. Neben klinischen Erkrankungen wie Meningitis, Septikämie, Arthritis und Bronchopneumonie treten auch asymptomatische Trägertiere auf. Es handelt sich bei S. suis aber auch um einen zoonotischen Erreger, welcher beim Menschen vorrangig Meningitis und Septikämie verursacht. Über die Pathogenese ist bisher nur wenig bekannt. Da das natürliche Habitat von S. suis der obere Respirationstrakt ist kann davon ausgegangen werden, dass die Überwindung der Epithelzellbarriere eine wichtige Rolle in der Frühphase der Infektion spielt. Ziel dieser Arbeit war es, sublytische Effekte von Suilysin (SLY) auf die Interaktion von S. suis mit Epithelzellen zu untersuchen. SLY gehört zur Familie der Cholesterol-bindenden Zytolysine. Neben der Porenbildung zeigen diese Toxine weitere wichtige Effekte, die bereits in sublytischen Konzentrationen auftreten und entscheidend zur Virulenz der Bakterien beitragen können. Zur Untersuchung der sublytischen Effekte von SLY wurden sly-negative Mutanten aus einem Serotyp-2-Wildtyp-Stamm und seiner kapsellosen Mutante erstellt. Diese wurden charakterisiert in der Interaktion mit humanen HEp-2-Epithelzellen. Zusätzlich wurde rekombinantes SLY (rSLY) hergestellt, SLY heterolog in Lactococcus lactis exprimiert und ein polyklonales rSLY-Kaninchenantiserum generiert. Nach der Charakterisierung der hämolytischen und zytotoxischen Eigenschaften der Mutanten und des rSLY wurden die Adhärenz- und Invasionsraten der S. suis‑Stämme unter sublytischen Bedingungen bestimmt. Es zeigte sich, dass die sly-positiven Stämme stärker adhärent und invasiv waren als die sly-negativen Mutanten, und dass bei den Mutanten durch Zugabe von rSLY der Wildtyp-Phänotyp wieder hergestellt werden konnte. Die Adhärenz und Invasion anderer, nicht invasiver Bakterien und die Internalisierung von Latexpartikeln ließ sich durch Zugabe von rSLY ebenfalls signifikant steigern. Somit ist davon auszugehen, dass SLY in der Lage ist die Zelle so zu stimulieren, dass es zu einer erhöhten Aufnahme von Bakterien oder Partikeln kommt. Durch Bindungs- und Depletionsstudien konnte Cholesterol als zellulärer Rezeptor von SLY ermittelt werden. Um die Mechanismen der SLY-vermittelten Invasion von S. suis in Epithelzellen zu charakterisieren, wurden Versuche mit spezifischen Hemmstoffen des Zytoskeletts und verschiedener Signaltransduktionswege durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass SLY das Aktinzytoskelett beeinflusst, indem es Rho-GTPasen, im Speziellen Rac, aktiviert. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass SLY in der Lage ist, die Expression von IL-8 und MCP-1 zu induzieren und den Transkriptionsfaktor NFκB zu aktivieren. Die Fähigkeit von S. suis zur Translokation durch eine polarisierte respiratorische Epithelzellschicht wurde mit humanen Calu-3-Zellen im Transwellsystem untersucht. Hier zeigte sich, dass S. suis auch unabhängig von SLY und der Kapsel eine intakte Zellschicht parazellulär durchdringen kann, ohne die Zellschicht zu zerstören. Diese Ergebnisse erlauben den Schluss, dass es sich bei SLY nicht um ein Adhäsin oder Invasin im engeren Sinne handelt, sondern dass SLY nach der Bindung an das Cholesterol der Zellmembran über verschiedene Wege der Zellaktivierung zu einer verstärkten Internalisierung des Erregers führt. Zusätzlich erreicht SLY möglicherweise durch die Aktivierung der Expression proinflammatorischer Zytokine eine Durchlässigkeit der Epithelzellbarriere, um damit den Eintritt von S. suis in tiefere Gewebsschichten zu erleichtern. Für die Translokation von S. suis durch eine intakte Zellschicht ist SLY allerdings vermutlich nicht essentiell.

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Neis, Christina: Sublytische Effekte von Suilysin auf Epithelzellen und deren Konsequenzen für die Invasion von Streptococcus suis. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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