Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Characterization of the epithelial stem cell niche of the human hair follicle

Klatte, Jennifer Elisabeth

Since the discovery of epithelial hair follicle (HF) stem cells in the bulge of human HFs, the definition of useful stem cell markers in situ has become a major challenge in skin research and regenerative medicine. In the current study, we contribute to this ongoing quest by critically evaluating published IR patterns of putative epithelial HF stem cells, and by attempting to identify markers for the in situ-identification of normal human epithelial HF stem cells within their physiological niche, using highly sensitive immunohistochemical relevant methods. In view of our findings, the most useful positive in situ-markers for human bulge cells turned out to be CK15, CK19 and CD200, even though these markers were not exclusively expressed in the bulge. Contrary to previous reports, we could not confirm that ß1 integrin IR is upregulated by normal human bulge keratinocytes in situ. The putative epithelial HF stem cell marker, Lhx2, also was not found to be upregulated here. However, the present study indicates that absent IR for CD34, connexin 43 and nestin may be exploited as negative markers for epithelial HF stem cells. Among the examined BM / mesenchymal markers, α6 integrin, fibronectin, nidogen, fibrillin-1 and LTBP-1 were expressed throughout the connective tissue sheath of human HFs, and no significant upregulation of these markers could be detected in or around the bulge. Instead, tenascin-C IR was significantly upregulated in the bulge, suggesting that tenascin-C constitutes a component of the bulge stem cell niche of human HFs. Therefore, this thesis reveals that the combined use of a limited panel of defined positive and negative markers helps to identify human bulge stem cells in situ. In addition, this thesis shows that a peculiar epithelial protrusion of the outer root sheath with distinct morphology (´follicular trochanter`) can serve as convenient lead structure for epithelial HF stem cell identification, at least in some patients. Finally, these analyses were concluded by exploring the functional significance of ß1 integrins in human HF biology. β1 integrins and their ligands (e.g. tenascin-C, fibronectin, fibrillin-1) are of particular interest, since e.g. ß1 integrin-deficient mice show severe, epithelial HF stem cell-related abnormalities in HF morphogenesis and cycling. However, the missing upregulation of ß1 integrin expression in the human HF bulge did not suggest a similarly prominent role for ß1 integrin in human compared to murine HF biology. Therefore, we also studied in microdissected, organ-cultured human anagen hair bulbs, whether blocking or stimulating ß1 integrin-mediated signalling affects at least defined functions of the progeny of these epithelial HF stem cells, i.e. hair bulb keratinocytes and the HS produced by them. We could demonstrate that human scalp HF IR for b1 integrin was most prominent in the outermost layer of the outer root sheath and the surrounding connective tissue sheath and that sites of b1 integrin IR co-express fibronectin and tenascin-C. Functionally, two activating b1 integrin antibodies (12G10, TS2/16) and ligand-mimicking RGD peptides promoted the growth of microdissected, organ-cultured human scalp HFs in vitro (i.e. stimulated hair matrix keratinocyte proliferation and HS elongation) and modulated human HF cycling [i.e. inhibited spontaneous hair follicle regression (catagen)]. These data provide the first available evidence that b1 integrin-mediated signalling is also important in human hair growth control. In summary, the current thesis has defined both, a useful panel of positive and negative markers, and distinctive morphological features that, together, facilitate the identification of human epithelial HF stem cell in their natural in situ context. This is complemented with the demonstration that, despite the fact that ß1 integrin expression is not a useful marker for human epithelial HF stem cells, ß1 integrin-mediated signalling still affects physiological key functions of their immediate cell progeny and may be pharmacologically targeted for stimulating human hair growth.

Seit der Entdeckung epithelialer Haarfollikelstammzellen in der Wulstregion humaner Haarfollikel ist die Definierung brauchbarer in situ Stammzellmarker zur größten Herausforderung in der Hautforschung und in der regenerativen Medizin geworden. Die vorliegende Studie sollte zum aktuellen Streben nach kritisch evaluierten, publizierten Immunreaktivitätsmustern vermeintlicher epithelialer Haarfollikelstammzellmarker beitragen, indem versucht wurde, Marker für die in situ Identifikation normaler humaner epithelialer Haarfollikelstammzellen innerhalb ihrer physiologischen Nische zu kennzeichnen. Nach den erhaltenen Befunden erwiesen sich CK15, CK19 und CD200 als die nützlichsten positiven in situ-Marker für humane Wulstregionzellen, auch wenn diese Marker nicht ausschließlich in der Wulstregion exprimiert wurden. Im Gegensatz zu vorherigen Ergebnissen konnte nicht bestätigt werden, dass die ß1 Integrin Immunreaktivität normaler humaner Wulstkeratinozyten in situ hochreguliert ist. Der mutmaßliche epitheliale Haarfollikelstammzellmarker Lhx2 war ebenfalls nicht hochreguliert zu identifizieren. Jedoch zeigt die vorliegende Arbeit, dass die fehlende Immunreaktivität von CD34, Connexin 43 und Nestin diese Substanzen als wichtige negative Marker für epitheliale Haarfollikelstammzellen ausweist. Unter den untersuchten Basalmembranmarkern und mesenchymalen Markern wurden α6 Integrin, Fibronektin, Nidogen, Fibrillin-1 und LTBP-1 im Bereich der gesamten äußeren Bindegewebsscheide humaner Haarfolikel exprimiert. Es konnte aber keine signifikante Hochregulation dieser Marker in oder um die Wulstregion herum detektiert werden. Stattdessen war Tenascin-C signifikant in der Wulstregion hochreguliert und stellt somit offenbar eine Komponente der Wulststammzellnische humaner Haarfollikel dar. Daher zeigt die vorliegende Arbeit, dass die kombinierte Anwendung einer limitierten Palette definierter positiver und negativer Marker hilft, humane Wulststammzellen in situ zu identifizieren. Zusätzlich wird hervorgehoben, dass ein auffälliger epithelialer Vorsprung der äußeren Wurzelscheide mit einer ausgeprägten Morphologie („follikulärer Trochanter“) als eine geeignete morphologische Leitstruktur für die Identifikation epithelialer Haarfollikelstammzellen dienen kann, zumindest bei einigen Patienten. Letztendlich wurden Analysen zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von ß1 Integrinen in der humanen Haarfollikelbiologie durchgeführt. ß1 Integrine und deren Liganden (z.B. Tenascin-C, Fibronektin, Fibrillin-1) sind von spezifischem Interesse seit z. B. nachgewiesen wurde, dass ß1 Integrin defiziente Mäuse schwere Abnormalitäten in der Haarfollikelmorphogenese und dem Haarzyklus aufweisen, die von epithelialen Haarfollikelstammzellen abhängig sind. Die fehlende Hochregulation der ß1 Integrin Expression in der humanen Wulstregion weist jedoch nicht darauf hin, dass ß1 Integrin eine ähnlich bedeutende Rolle beim Menschen wie in der murinen Haarfollikelbiologie spielt. Daher wurde zusätzlich an mikrodisseziierten, organ-kultivierten humanen Anagen-Haarbulbi geprüft, ob blockierende oder stimulierende ß1 Integrin-vermittelte Signaleffekte definierte Funktionen bei den Nachkommen dieser epithelialen Haarfollikelstammzellen ausüben, d.h. die Haarbulbuskeratinozyten und die von ihnen produzierten Haarschäfte. Es konnte gezeigt werden, dass die Immunreaktivität humaner Skalphaarfollikel für ß1 Integrin in der äußersten Schicht der äußeren Wurzelscheide und der umgebenden äußeren Bindegewebsscheide am prominentesten war und dass diese Bereiche der ß1 Integrin Immunreaktivität Fibronektin und Tenascin-C koexprimieren. Funktionell förderten die beiden aktivierenden ß1 Integrin Antikörper (12G10, TS2/16) und ligandenimitierenden RGD-Peptide das Wachstum mikrodisseziierter organ-kultivierter humaner Skalphaarfollikel in vitro, d.h. sie stimulierten die Proliferation der Haarmatrixkeratinozyten und die Haarschaftelongation und modulierten den humanen Haarfollikelzyklus durch die Verminderung einer spontanen Haarfollikelregression (Katagen). Diese Daten liefern den ersten Beweis dafür, dass b1 Integrin-vermittelte Signale auch für die Kontrolle des menschlichen Haarwachstums Bedeutung haben. Zusammenfassend hat die vorliegende Doktorarbeit zweierlei definiert: a) eine nützliche Palette positiver und negativer Marker mit markanten Struktureigenschaften, die b) zusammen die Identifikation humaner epithelialer Haarfollikelstammzellen in ihrem natürlichen in situ Umfeld vereinfachen. Neben der Tatsache, dass die Expression von b1 Integrin kein nützlicher Marker für humane epitheliale Stammzellen ist, können b1 Integrin-vermittelte Signale immer noch physiologische Schlüsselfunktionen für ihre unmittelbaren Zellnachkommen besitzen und vielleicht auch ein pharmakologisches Ziel für stimulierendes Haarwachstum sein.

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Klatte, Jennifer Elisabeth: Characterization of the epithelial stem cell niche of the human hair follicle. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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