Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Lectin and immuno histochemical investigations on cellular alterations in chicken embryos following inoculation with Newcastle Disease Virus (NDV) of different virulence

Rodríguez Barahona, Julia Victoria

Newcastle disease (ND) is a worldwide disease of poultry caused by a Paramyxovirus type 1, genus Avulavirus. The principal receptor of this virus is 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuraminic acid. By means of histological techniques, including histochemistry, with special emphasis on lectin histochemistry and immunohistochemistry, tissue changes occurring in specific pathogen free (SPF) chicken embryos infected with NDV of different pathotypes (HB-1 and Komarov) were investigated in comparison to uninfected chicken embryos. For this purpose, our study was divided into two main parts: (1) Determination of the LD50 of the NDV pathotypes under study and (2) Histological studies in chicken embryos as mentioned above to determine the distribution of free sugar moiëties and presence of NDV in various organs of the chicken embryos. After euthanization, the embryos were fixed in Bouin’s solution, embedded in paraffin wax, and 5 μm sections were stained with four biotinylated lectins [Con A (sugar specifity: α-D-mannose/glucose), BSA-1 (sugar specifity: α-D-galactose), WGA (sugar specifity: β-D-N-acetylglucosamine) and MAA (sugar specifity: siaα-2,3-galactose)]. Immunohistochemical staining to detect the organ distribution of NDV, was done employing a polyclonal antibody against ND virus raised in rabbits. Different intensities of lectin staining were observed in the uninfected control group, indicating the presence of free sugar residues depending on the tissue type studied, incubation time and the lectin used. Apical parts of the epithelial cells of esophagus, proventriculus, trachea, lung and air sac exhibited strong to medium staining reactions with Con A, BSA-1 and WGA. These cells showed a significantly positive immunochemical reactions (Fisher's Exact Test <0,05) in both infected groups (NDV-Komarov and HB-1 pathotype) at day 11th compared to day 15th of incubation, when only 1 of the infected with NDV-Komarov pathotype and 1 infected with NDV-HB-1 pathotype were found NDV positive. Such coincidence was not observed when a rather weak MAA reaction and distinct immuno histochemical antivirus staining were found. The latter finding may be caused by the presence of 2-deoxy-2,6-dehydro-N-acetyl-neuraminic acid as a second receptor of NDV not recognized by MAA. At present, we can not explain the reaction difference in immuno histochemistry between day 11 and day 15 of incubation, but it may be speculated that this observation is attributable to resorption of possibly proteinaceous substances during the process of drinking amniotic fluid, both beginning about day 13 of incubation. Stronger lectin staining reactions were observed in infected organs of the chicken embryos infected at 11th; when compared to the uninfected controls. In these cases, significant differences were observed in the epithelium of the trachea with Con A, BSA-1, and the epithelium and goblet cells in the ventriculus with MAA when they were analyzed by Fisher´s Exact Test (<0,05). Further investigations are necessary to elucidate the role of the different sugar moiëties in virus infection, because they are very important structures in biological processes such as cell-cell interactions and pathogen entry into the host cell. In summary, the findings presented herein for the first time describe the (1) distribution of four different sugar moieties in various organs of the chicken embryo and (2) changes induced following infection with two different pathotypes of NDV. This may be the basis for further pathogenesis studies employing chicken embryos and their interaction with pathogens on the cellular level.

Die Newcastle Krankheit (NK) ist eine weltweit verbreitete Geflügelkrankheit, die durch eine Infektion mit dem Paramyxovirus Typ 1, Genus Avulavirus, hervorgerufen wird. Der bedeutendste zelluläre Rezeptor ist 2-deoxy-2,3 dehydro-N-acetyl-Neuraminsäure. Mittels histologischer einschließlich histochemischer und immunhistochemischer Techniken, die schwerpunktmäßig auf Lektinhistochemie ausgerichtet waren, wurden Gewebeveränderungen in spezifisch pathogenfreien (SPF) Hühnerembryonen untersucht, die mit den Newcastle Krankheit Virus (NKV) verschiedener Pathotypen (HB-1 und Komarov) infiziert worden waren. Parallel hierzu wurden nicht infizierte Hühnerembryos untersucht. Diese Studie wurde in zwei Teilen aufgeteilt: (1) Bestimmung der LD50 des NDV-Pathotypen und (2) Histologische Studien an Hühnerembryonen (s. o), um die normale Verteilung der freien Zuckerbindungen und die Präsenz von NDV in verschiedenen Organen der Hühnerembryonen festzustellen. Hierzu wurden mit 4 biotinylierten Lektinen gearbeitet: [Con A (Zuckerspezifität: α-D-mannose/glucose), BSA-1 (Zuckerspezifität: α-D-galactose), WGA (Zuckerspezifität: β-D-N-acetylglucosamine) und MAA (Zuckerspezifität: siaα-2,3-galactose)]. Immunhistologische Färbungen wurden mit polyklonalen Antikörpern gegen NKV durchgeführt. Unterschiedliche Intensitäten von Lektinfärbungen wurden in der nicht infizierten Kontrollgruppe beobachtet, wobei die freien Zucker-Reste von der Art des Gewebes, der Inkubationszeit und den verwendeten Lektine abhängig war. Der apikale Teil der Epithelzellen des Oesophagus, Vormagens, der Trachea, Lunge und den Luftsäcken zeigte jeweils starke bis mittlere Reaktionen mit Con A, BSA-1 und WGA. Diese Zellen zeigten deutlich positive immunhistochemische Reaktionen (Fisher's Exact-Test <0,05) in beiden infizierten Gruppen (NKV Komarov und NKV HB-1) am Tag 11 im Vergleich zu Tag 15 der Inkubation, wobei nur ein infizierter NKV-Komarov Embryo und ein infizierter NDV-HB-1 Embryo gefunden wurde. Es wurde dagegen kein Zusammenhang zwischen MAA Reaktionen und dem immunhistochemischen Virusnachweis gefunden. Das letztgenannte Ergebnis könnte durch das Vorhandensein eines zweiten Rezeptors (2-deoxy-2,6-dehydro-N-acetyl-Neuraminsäure) für NKV erklärt werden, welcher nicht durch MAA nachgewiesen wird. Zur Zeit können wir die unterschiedliche immunhistochemischen Reaktionen zwischen dem 11 und dem 15 Tag der Inkubation nicht erklären. Es kann aber angenommen werden, dass diese Beobachtung mit der Resorption von interferierenden proteinhaltigen Substanzen nach Aufnahme von Amnionflüssigkeit, beginnend am 13. Tag der Inkubation, in Zusammenhang steht. Eine in Vergleich zur (nicht infizierten) Kontrollgruppe signifikant positive Reaktion von Lektinen wurde in den Organen von Hühnerembryonen beobachtet die am 11. Tag der Inkubation infiziert worden waren. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die Rolle der verschiedenen Zucker-Reste bei Virusinfektionen aufzuklären, da es sich hierbei um wichtige Strukturen handelt, die um in biologischen Prozessen, wie z. B. Zell-Zell-Interaktionen und dem Eintritt von Krankheitserregern in die Wirtszelle beteiligt sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegenden Ergebnisse erstmalig (1) die Verteilung der vier verschiedenen Zucker-Reste in verschiedenen Organen des Hühnerembryos und (2) die Veränderungen welche nach Infektion mit zwei verschiedenen Pathotypen der NKV beschreiben. Dies kann die Grundlage für weitere Studien zur Interaktion von Krankheitserregern und verschiedenen Organen auf zelluläre Ebene, insbesondere im Hinblick auf die Glykosylierungsmuster von Zellen sein.

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Rodríguez Barahona, Julia Victoria: Lectin and immuno histochemical investigations on cellular alterations in chicken embryos following inoculation with Newcastle Disease Virus (NDV) of different virulence. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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