Versuche zur Vitrifikation equiner Spermatozoen im Vergleich zur konventionellen Tiefgefrierung mit und ohne Verwendung von Kryoprotektiva

Ziel der vorliegenden Arbeit war ein Vergleich des konventionellen mit einem vitrifikationsähnlichen Einfrierverfahren. Zudem sollte festgestellt werden, ob die Kryokonservierung mit im Vergleich zur Kryokonservierung ohne Glycerol von Vorteil ist. Es standen 12 Hengste (6 mit empirisch guter, 6 mit empirisch ungünstiger Tiefgefriereignung) des Nds. Landgestüts Celle zur Verfügung. Verglichen wurden die Spermienmotilität, die Membranintegrität und der akrosomale Status. Die Untersuchung der Spermienchromatinstruktur (SCSA) erfolgte nur im Hauptversuch. Es wurde eine Signifikanzgrenze von p ≤ 0,05 festgelegt. Vorversuch 1: (n = 1, m = 3) Es wurden unterschiedliche Ethylenglycolgehalte und drei unterschiedliche Gefriermethoden angewendet. Die Proben wurden konventionell kryokonserviert, sowie mit Pailletten und mit VitriPlugs vitrifikationsähnlich tiefgefroren. Die Ethylenglycolkonzentration hatte keinen Einfluss auf die untersuchten Parameter. Die Kryokonservierung mit VitriPlugs führte zu den schlechtesten Ergebnissen. In Hinblick auf die Membran- und Akrosomintegrität war die konventionelle Kryokonservierung überlegen. Vorversuch 2: (n = 1, m = 3) Es kamen drei verschiedene Filtrationsverfahren (Swim-up, PercollTM, EquiPureTM) zum Tragen. Die Proben wurden konventionell kryokonserviert und mit Cryoloops sowie mit Pailletten vitrifikationsähnlich tiefgefroren. Die Hälfte der Proben wurde mit je 2,5 % Glycerol versetzt, die andere Hälfte wurde ohne Glycerol kryokonserviert. Das Swim-up-Verfahren zeigte die signifikant schlechtesten Ergebnisse. Das konventionelle war dem vitrifikationsähnlichen Verfahren überlegen. Die Kryokonservierung mit Cryoloops führte zu den schlechtesten Ergebnissen. Die Verwendung von Glycerol hatte keinen signifikanten Einfluss. Hauptversuch: (n = 13, m = 3) Zwei Filtrationsverfahren kamen zum Einsatz (PercollTM, EquiPureTM). Die Kryokonservierung erfolgte konventionell und vitrifikationsähnlich mittels Pailletten. Dafür wurde eine Hälfte mit 2,5 % Glycerol kryokonserviert, die andere Hälfte wurde ohne Glycerol tiefgefroren. Bei Verwendung von Glycerol wurden in Bezug auf Membranintegrität und Vorwärtsmotilität dabei die besseren Ergebnisse erzielt. Die DNA-Integrität wurde in keinem Fall von der Glycerolverwendung beeinflusst. Die Kryokonservierung mittels des vitrifikationsähnlichen Verfahrens führte bezüglich mittlerer Geschwindigkeit und Chromatinstruktur der Spermatozoen zu mit der konventionellen Kryokonservierung vergleichbaren Ergebnissen. Hinsichtlich der Vorwärtsmotilität, der Membran- und der Akrosomintegrität war das konventionelle dem vitrifikationsähnlichen Verfahren überlegen. Ein Vorteil durch die Anwendung eines Dichtegradientenzentrifugationsverfahrens war nicht festzustellen. Ausgehend von den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit bietet die hier entwickelte Methodik zur Vitrifikation von Spermien in der equinen Reproduktionsmedizin bisher keine Vorteile gegenüber der konventionellen Kryokonservierung.