Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Versuche zur Vitrifikation equiner Spermatozoen im Vergleich zur konventionellen Tiefgefrierung mit und ohne Verwendung von Kryoprotektiva

Behrendt, Daphne Maria Rani

The objective of this study was to compare the conventional to a vitrification-like freezing method. Furthermore it should be investigated whether the use of glycerol would be beneficial to the success of cryopreservation or whether it might be possible to cryopreserve equine spermatozoa without the use of any cryoprotective agents. Semen was collected from 12 Hanoverian stallions (6 good freezers, 6 poor freezers) belonging to the state studfarm of Lower Saxony at Celle. Sperm motility, membrane integrity and acrosomal status were compared. The sperm chromatin structure was analyzed only within the main experiment. The level of statistical significance was set at p≤0,05. Preliminary Experiment 1: (n = 1, m = 3) Four different concentrations of ethylene glycol were used as well as three different freezing methods. Cryopreservation of samples was perfomed conventionally and vitrification-like by the use of either straws or VitriPlugs. The concentration of ethylene glycol had no influence on any of the parameters that were assessed. Worst results were achieved through cryopreservation by VitriPlugs. With reference to the acrosomal status and the membrane integrity of spermatozoa conventional freezing turned out to be superior to vitrification. Preliminary Experiment 2: (n = 1, m = 3) Three different filtration methods (Swim-up, PercollTM, EquiPureTM) were performed. Samples were cryopreserved conventionally and vitrification-like with straws and Cryoloops. To half of the samples 2,5 % glycerol was added, the other half was cryopreserved without the use of glycerol. Worst results were achieved following swim-up-preparation. Conventional freezing turned out to be superior to vitrification. Cryopreservation with Cryoloops led to worst results. The use of glycerol had no significant influence. Main Experiment: (n = 13, m = 3) Two different filtration methods (PercollTM, EquiPureTM) were performed. Cryopreservation was conducted conventionally and vitrification-like with straws. To half of the samples 2,5 % glycerol was added, the other half was cryopreserved without the use of glycerol. With respect to progressive motility and membrane integrity the use of glycerol lead to better results, whereas on DNA-integrity the use of glycerol had no influence. Considering progressive motility and average velocity vitrification in straws lead to results comparable to those achieved by conventional freezing. Considering progressive motility, membrane integrity and acrosomal status conventional freezing was superior to vitrification. The use of the density centrifugation method was of no advantage. Based on the results of this study vitrification of sperm in equine reproductive medicine has no advantages over conventional freezing.

Ziel der vorliegenden Arbeit war ein Vergleich des konventionellen mit einem vitrifikationsähnlichen Einfrierverfahren. Zudem sollte festgestellt werden, ob die Kryokonservierung mit im Vergleich zur Kryokonservierung ohne Glycerol von Vorteil ist. Es standen 12 Hengste (6 mit empirisch guter, 6 mit empirisch ungünstiger Tiefgefriereignung) des Nds. Landgestüts Celle zur Verfügung. Verglichen wurden die Spermienmotilität, die Membranintegrität und der akrosomale Status. Die Untersuchung der Spermienchromatinstruktur (SCSA) erfolgte nur im Hauptversuch. Es wurde eine Signifikanzgrenze von p ≤ 0,05 festgelegt. Vorversuch 1: (n = 1, m = 3) Es wurden unterschiedliche Ethylenglycolgehalte und drei unterschiedliche Gefriermethoden angewendet. Die Proben wurden konventionell kryokonserviert, sowie mit Pailletten und mit VitriPlugs vitrifikationsähnlich tiefgefroren. Die Ethylenglycolkonzentration hatte keinen Einfluss auf die untersuchten Parameter. Die Kryokonservierung mit VitriPlugs führte zu den schlechtesten Ergebnissen. In Hinblick auf die Membran- und Akrosomintegrität war die konventionelle Kryokonservierung überlegen. Vorversuch 2: (n = 1, m = 3) Es kamen drei verschiedene Filtrationsverfahren (Swim-up, PercollTM, EquiPureTM) zum Tragen. Die Proben wurden konventionell kryokonserviert und mit Cryoloops sowie mit Pailletten vitrifikationsähnlich tiefgefroren. Die Hälfte der Proben wurde mit je 2,5 % Glycerol versetzt, die andere Hälfte wurde ohne Glycerol kryokonserviert. Das Swim-up-Verfahren zeigte die signifikant schlechtesten Ergebnisse. Das konventionelle war dem vitrifikationsähnlichen Verfahren überlegen. Die Kryokonservierung mit Cryoloops führte zu den schlechtesten Ergebnissen. Die Verwendung von Glycerol hatte keinen signifikanten Einfluss. Hauptversuch: (n = 13, m = 3) Zwei Filtrationsverfahren kamen zum Einsatz (PercollTM, EquiPureTM). Die Kryokonservierung erfolgte konventionell und vitrifikationsähnlich mittels Pailletten. Dafür wurde eine Hälfte mit 2,5 % Glycerol kryokonserviert, die andere Hälfte wurde ohne Glycerol tiefgefroren. Bei Verwendung von Glycerol wurden in Bezug auf Membranintegrität und Vorwärtsmotilität dabei die besseren Ergebnisse erzielt. Die DNA-Integrität wurde in keinem Fall von der Glycerolverwendung beeinflusst. Die Kryokonservierung mittels des vitrifikationsähnlichen Verfahrens führte bezüglich mittlerer Geschwindigkeit und Chromatinstruktur der Spermatozoen zu mit der konventionellen Kryokonservierung vergleichbaren Ergebnissen. Hinsichtlich der Vorwärtsmotilität, der Membran- und der Akrosomintegrität war das konventionelle dem vitrifikationsähnlichen Verfahren überlegen. Ein Vorteil durch die Anwendung eines Dichtegradientenzentrifugationsverfahrens war nicht festzustellen. Ausgehend von den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit bietet die hier entwickelte Methodik zur Vitrifikation von Spermien in der equinen Reproduktionsmedizin bisher keine Vorteile gegenüber der konventionellen Kryokonservierung.

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Behrendt, Daphne Maria Rani: Versuche zur Vitrifikation equiner Spermatozoen im Vergleich zur konventionellen Tiefgefrierung mit und ohne Verwendung von Kryoprotektiva. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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