Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Immunhistochemische Charakterisierung von olfaktorischen Rezeptorneuronen und Gliazellen in der Riechschleimhaut des Hundes

Bock, Patricia Petra Monika

Traumatic spinal cord injuries in dogs are among the most frequent neurologic disorders in veterinarian medicine. Despite great therapeutical progress, the prognosis for affected animals is still poor or hopeless in about half of the cases. Due to their regeneration-promoting capacities, glial cells of the olfactory epithelium, the olfactory ensheathing cells (OECs), have gained wide interest as promising candidates for cell transplantation based therapies of nervous system injury and disease. In the olfactory epithelium, which displays neurogenesis throughout lifetime, new olfactory neurons arise from basal, are transferred to the middle and apical third of the epithelium during maturation and give rise to axons that enter the olfactory bulb. Groups of these olfactory axons are enfolded by OECs. Based on the well known property of peripheral glia to promote axonal growth, it was hypothetized that OECs bear unique regeneration-promoting capacities. In recent years it was shown, that OECs actually can promote neural regeneration under experimental conditions. Moreover, in vivo studies suggested that adult canine OECs may display similar regenerating capacities as their rodent counterpart. Due to the fact that the molecular phenotype of OECs is still only partially characterized, there are no cell type-specific markers available which could be used for purification and exact determination of their distribution within the respiratory epithelium. One aim of the present study was, therefore, to define cell type-specific markers for OECs or Schwann cells which could be used for antibody-based purification of cell suspensions. For this purpose the expression of two putative cell type-specific molecules, the carbohydrate HNK-1 epitope and the neurotrophin receptor p75NTR, was comparatively analyzed in adult canine Schwann cells and OECs in situ and correlated to in vitro-results. As the presence of OECs is closely linked to the localization of olfactory neurons, another aim of this study was to investigate the molecular character and distribution of adult canine olfactory neurons in more detail.  By this means, the distribution of OECs in the olfactory mucosa should be analyzed in an indirect way. Obtained data were subsequently compared to findings in the vomeronasal organ. Myelinating and non-myelinating Schwann cells in situ exclusively expressed HNK-1 and p75NTR, respectively, while OECs were negative for both markers. In contrast, in vitro, both Schwann cells and OECs showed cell surface expression of p75NTR, while the HNK-1 antigen could only be detected in intracellular vesicles. This shows that OECs upregulate p75NTRin vitro and that HNK-1-immunoreactivity of both cell types is based on phagocytosis of HNK-1-antigen and not due to own cellular synthesis. The cultivation-induced changes of HNK-1 expression in Schwann cells and p75NTR-expression in OECs indicates a crucial role of axonal signals for the expression of both molecules in situ. In conclusion, this part of the study revealed that neither p75NTR nor HNK-1 represent OEC- or Schwann-cell-specific marker molecules but that their in situ and in vitro different antigenic phenotype offers the opportunitiy of an antibody-based purification of cell-preparations from the olfactory epithelium or bulb. Interestingly, HNK-1 expression in the adult dog was found both in sensory and motor axon myelinating Schwann cells. This is similar to humans and differs from rodents and underscores the importance of the dog as a translational model. In addition, for the first time, HNK-1 was found in a subpopulation of adult canine olfactory and vomeronasal neurons. The second part of the study showed that the adult canine olfactory epithelium is composed of two distinct regions, designated A and B, that do not only differ in olfactory neuron morphology, marker expression and basal cell proliferation, but also displayed a patchy distribution and preferential localizations within the nasal mucosa. Type A, abundant in the caudal part of the olfactory area, contained well-differentiated olfactory neurons positive for OMP but relatively low numbers of immature neurons and proliferating basal cells, as visualized by TrkB-/HNK-1- and Ki-67-immunostaining, respectively. In contrast, type B was mainly found in the rostral part of the olfactory area and contained smaller and elongated neurons that displayed a more immature morphology and increased levels of TrkB- and HNK-1-immunoreactivity and a higher number of Ki-67-positive basal cells but lower and variable levels of OMP. The vomeronasal organ displayed a uniform distribution of molecular markers and proliferating basal cells. The observation that OMP in region A and B was preferentially localized to the nucleus and cytoplasm, respectively, implies a possible correlation between subcellular localization of the molecule and olfactory neuron maturation and may indicate new functional roles of OMP. Whether the detected heterogeneity in the adult canine olfactory epithelium is modulated by physiological parameters, such as airflow, has to be clarified by future studies.

Traumatische Rückenmarksverletzungen des Hundes gehören zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen in der veterinärmedizinischen Praxis. Trotz großer therapeutischer Fortschritte ist die Prognose für betroffene Tiere in etwa der Hälfte der Fälle immer noch schlecht bis infaust. Gliale Zellen des olfaktorischen Epithels, olfaktorische Hüllzellen (OECs), gelten als vielversprechende Kandidaten für zelltransplantationsbasierte Therapien von Verletzungen und Krankheiten des Nervensystems. Im olfaktorischen Epithel, welches sich durch lebenslange Neurogenese auszeichnet, entstehen neue olfaktorische Rezeptorneurone basal, gelangen während ihrer Reifung in das mittlere und apikale Drittel des Epithels und entsenden Axone zum Bulbus olfactorius. OECs wiederum umschließen Gruppen dieser olfaktorischen Axone. Ausgehend von der allgemein bekannten Eigenschaft peripherer Glia, axonales Wachstum zu fördern, wurde postuliert, dass OECs einzigartige regenerationsfördernde Effekte vermitteln. In den letzten Jahren wurde gezeigt, das OECs tatsächlich neuronale Regeneration unter experimentellen Bedingungen fördern können. In vivo-Studien ließen darüber hinaus vermuten, dass adulte kanine OECs möglicherweise den OECs der Ratte vergleichbare regenerative Fähigkeiten besitzen. Aufgrund der nur unvollständigen Charakterisierung des molekularen Phänotyps kaniner OECs sind bislang allerdings keine zelltypspezifischen Marker verfügbar, die zur Reinigung bzw. zur genauen Bestimmung ihres Verteilungsmusters in der Riechschleimhaut verwendet werden können. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, zelltypspezifische Marker für OECs oder Schwann-Zellen zu identifizieren, die zur Antikörper-gestützten Reinigung von Zellsuspensionen genutzt werden können. Hierzu wurde die Expression zweier potentiell zelltypspezifischer Moleküle, des Zuckerepitopes HNK-1 und des Neurotrophinrezeptors p75NTR, in adulten kaninen Schwann-Zellen und OECs in situ vergleichend analysiert und mit in vitro-Ergebnissen korreliert. Da die Anwesenheit von OECs unmittelbar mit der Lokalisation olfaktorischer Rezeptorneurone assoziiert ist, war es ein weiteres Ziel dieser Studie, den molekularen Charakter und das Verteilungsmuster adulter kaniner olfaktorischer Rezeptorneurone detaillierter zu untersuchen. Auf diese Weise sollte das Verteilungsmuster von OECs in der Riechschleimhaut auf indirektem Wege analysiert werden. Die erhobenen Daten wurden anschließend mit Ergebnissen aus dem Vomeronasalorgan verglichen. Myelinisierende und nicht-myelinisierende Schwann-Zellen exprimierten in situ HNK-1 bzw. p75NTR, während OECs keines der beiden Antigene enthielten. In vitro hingegen zeigten sowohl Schwann-Zellen als auch OECs eine p75NTR-Expression auf der Zelloberfläche, während HNK-1-Antigen lediglich in intrazellulären Vesikeln nachgewiesen werden konnte. Dies zeigte zum einen, dass OECs in vitro p75NTRhochregulieren und zum anderen, dass die HNK-1-Immunreaktivität beider Zelltypen auf die Phagozytose von HNK-1-Antigen und nicht auf eigene zelluläre Synthese zurückzuführen ist. Die durch die Kultivierung bedingte Veränderung der HNK-1-Expression in Schwann-Zellen und der p75NTR-Expression in OECs ist Beleg dafür, dass axonale Signale die Expression beider Moleküle in situ kontrollieren. Folglich zeigte dieser Teil der Studie, dass es sich weder bei p75NTR noch bei HNK-1 um spezifische Markermoleküle für OECs bzw. Schwann-Zellen handelt, dass jedoch ihr in situ und in vitro unterschiedlicher antigener Phänotyp eine Antikörper-gestützte Reinigung von Zellpräparationen aus dem olfaktorischen Epithel oder dem Bulbus olfactorius ermöglichen könnte. Interessanterweise fand sich die HNK-1-Expression beim Hund sowohl in mit sensorischen als auch in mit motorischen Axonen assoziierten myelinisierenden Schwann-Zellen. Dies findet sich in ähnlicher Art und Weise beim Menschen, nicht aber beim Nager und unterstreicht die Bedeutung des Hundes als translationales Modell. Darüber hinaus wurde HNK-1 erstmalig in einer Subpopulation adulter kaniner olfaktorischer und vomeronasaler Rezeptorneurone nachgewiesen. Der zweite Teil der Studie zeigte, dass das adulte kanine olfaktorische Epithel aus zwei, hier als Typ A und B bezeichneten Regionen besteht, welche sich nicht nur in der Morphologie der olfaktorischen Rezeptorneurone, der Markerexpression und der Basalzell-Proliferation unterschieden, sondern auch eine fleckenhafte Verteilung und bevorzugte Lokalisationen innerhalb der Nasenschleimhaut aufwiesen. Typ A befand sich vorwiegend im kaudalen Bereich der Riechschleimhaut und enthielt gut differenzierte, OMP-positive olfaktorische Rezeptorneurone aber nur einen relativ geringen Anteil unreifer Neurone und proliferierender Basalzellen, dargestellt mittels TrkB-/HNK-1- bzw. Ki-67-Immunreaktivität. Im Gegensatz hierzu fand sich Typ B hauptsächlich im rostralen Bereich und enthielt schmalere und längliche Neurone von eher unreifer Morphologie und mit erhöhter TrkB und HNK-1-Immunreaktivität sowie eine höhere Anzahl Ki-67-positiver Basalzellen bei geringerer und variabler OMP-Expression. Das Vomeronasalorgan wies eine gleichmäßige Verteilung molekularer Marker und proliferierender Basalzellen auf. Die Beobachtung, dass OMP in der Region A vorwiegend im Zellkern, in der Region B hingegen im Zytoplasma lokalisiert war, lässt einen Zusammenhang zwischen der subzellulären Lokalisation des Moleküls und der Reifung olfaktorischer Rezeptorneurone vermuten und könnte auf neue funktionelle Bedeutungen von OMP hinweisen. Die Klärung der Frage, inwieweit die im kaninen olfaktorischen Epithel beobachtete Heterogenität von physiologischen Parametern, wie z.B. dem Luftstrom, beeinflusst wird, bleibt zukünftigen Studien vorbehalten.

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Bock, Patricia Petra Monika: Immunhistochemische Charakterisierung von olfaktorischen Rezeptorneuronen und Gliazellen in der Riechschleimhaut des Hundes. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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