Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung zur Pharmakokinetik von Betamethason nach intravenöser und dermaler Applikation hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

Dikker, Lieke

The goal of the study at hand was the development and validation of a suitable method of analysis for betamethasone in equine plasma and urine in order to conduct pharmacokinetic tests after intravenous and dermal application. The developed assay, consisting of sample preparation and subsequent measurement by means of HPLC/MS/MS, was validated according to the following criteria: accuracy, precision, selectivity, linearity, stability and recovery. The limit of quantification for betamethasone was 0.1 ng/ml in plasma; in urine the limit of quantification was 0.05 ng/ml. The limit of detection for betamethasone was 0.02 ng/ml in plasma and 0.01 ng/ml in urine. In three trials, six horses were treated with betamethasone, respectively. For the intravenous trial, Celestan® solubile was injected intravenously at a singular dosage rate of 0.04 mg betamethasone per kg of body weight. For the dermal trials, Celestan®-V ointment was applied to two areas of different size. In the first dermal trial, 4 g of Celestan®-V ointment was applied to an area of 10 x 10 cm; in the second dermal trial, 8 g Celestan®-V ointment was applied to an area of 10 x 20 cm. After intravenous injection of betamethasone, the limit of detection for plasma was reached within 80 hours, and the limit of detection for urine was reached within 292 hours. In the dermal trial using 8 g of Celestan®-V ointment, the limit of detection for plasma and urine were reached within 64 hours and 232 hours, respectively. In addition to the detection of betamethasone concentrations in plasma and urine, the cortisol concentrations in plasma and urine were determined in order to judge the effect of various application methods of glucocorticoids on those parameters. After intravenous injection a suppression of cortisol levels for 48 hours was demonstrated. The dermal application of 4 g of Celestan®-V ointment showed no significant effect on the cortisol levels, but the application of 8 g of Celestan®-V ointment lead to a suppression of cortisol levels after 24 and 96 hours. The data raised after the intravenous injection of Celestan® solubile was sufficient for the calculation of pharmacokinetic parameters for betamethasone. For this calculation a two-compartment-model was used. According to the calculation the maximum concentration averages at 51 ng/ml and the half-life was 3.35 hours on average. The results of this study reveal that a general statement regarding the elimination time of betamethasone in view of the entire population is inacceptable as there are large interindividual fluctuations. This work confirms that the dermal application of betamethasone can lead to the positive result of a doping test. A distinction between the different forms of application solely by determining the betamethasone concentrations in plasma or urine is not possible. Any detection of betamethasone in plasma or urine samples should be considered as relevant for doping and should be punished appropriately.

Ziel der durchgeführten Studie war die Entwicklung und Validierung einer geeigneten Analysemethode für Betamethason in equinem Plasma und Urin, um pharmakokinetische Untersuchungen nach intravenöser und dermaler Applikation bei Pferden durchführen zu können. Die entwickelte Analysemethode, bestehend aus der Probenaufarbeitung und anschließender Messung mittels HPLC/MS/MS, wurde nach den Parametern Richtigkeit, Präzision, Selektivität, Linearität, Stabilität und Wiederfindung validiert. Die Quantifizierungsgrenze für Betamethason lag im Plasma bei 0,1 ng/ml und im Urin bei 0,05 ng/ml und die Nachweisgrenze lag im Plasma bei 0,02 ng/ml und im Urin bei 0,01 ng/ml. In drei Versuchen ist jeweils sechs Pferden Betamethason appliziert worden. Zum einen ist Celestan® solubile in einer Dosierung von 0,04 mg Betamethason pro kg Körpergewicht intravenös verabreicht worden. Zum anderen ist Celestan®-V Salbe dermal auf zwei verschieden großen Flächen appliziert worden. Dabei handelte es sich um eine Dosierung von 4 g Celestan®-V Salbe auf eine 10 x 10 cm große Fläche und 8 g Celestan®-V Salbe auf eine 10 x 20 cm große Fläche. Nach intravenöser Applikation von Betamethason wurde die Nachweisgrenze im Plasma nach 51 Stunden und im Urin nach 132 Stunden unterschritten. Nach dermaler Verabreichung von 4 g Celestan®-V Salbe lagen die Betamethasonwerte im Plasma nach 80 Stunden und im Urin nach 292 Stunden unterhalb der Nachweisgrenze. Die Nachweisgrenze der mit 8 g Celestan®-V Salbe behandelten Pferde lag im Plasma nach 64 Stunden und im Urin nach 232 Stunden unterhalb der Nachweisgrenze. Neben der Bestimmung der Betamethasonkonzentrationen in Plasma und Urin wurden zusätzlich die Cortisolkonzentrationen im Plasma ermittelt, um den Einfluss von Glukokortikoiden nach unterschiedlichen Applikationsformen auf diesen Parameter beurteilen zu können. Nach intravenöser Verabreichung konnte eine Cortisolsuppression über 48 Stunden gezeigt werden. Nach dermaler Applikation von 4 g Celestan®-V Salbe war keine signifikante Suppression des Cortisol messbar und nach dermaler Applikation von 8 g Celestan®-V Salbe ergaben sich nach 24 und 96 Stunden supprimierte Cortisolwerte. Das nach intravenöser Applikation von Celestan® solubile erhaltene Datenmaterial war ausreichend um damit pharmakokinetische Parameter für Betamethason zu berechnen. Für die Berechnung wurde ein Zwei-Kompartiment-Modell verwendet. Die Maximalkonzentration lag nach den Berechnungen im Mittel bei 51 ng/ml und die Halbwertszeit lag im Mittel bei 3,35 Stunden. Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass aufgrund der großen interindividuellen Schwankungen keine definitive, auf die Gesamtpopulation übertragbare Aussage über die Ausscheidungszeit von Betamethason gemacht werden kann. Die Möglichkeit einer positiven Dopingprobe nach dermaler Applikation von Betamethason wurde in dieser Arbeit bestätigt. Eine Unterscheidung der Applikationsformen anhand der ermittelten Betamethasonkonzentrationen ist jedoch nicht möglich. Jeglicher Nachweis von Betamethason im Plasma oder Urin muss daher als dopingrelevant gelten und entsprechend geahndet werden.

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Dikker, Lieke: Untersuchung zur Pharmakokinetik von Betamethason nach intravenöser und dermaler Applikation hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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