Molecular genetic analysis of bilateral convergent strabismus with exophthalmus in German Brown cattle

Ziel dieser Arbeit war es, Genomregionen und Gene zu identifizieren und zu charakterisieren, die für den bilateralen Strabismus convergens beim Deutschen Braunvieh verantwortlich sind. Durch eine nicht-parametrische Kopplungsanalyse mit 164 Mikrosatelliten und 13 SNPs anhand 10 für BCSE segregierenden Familien konnten zwei putative Genomregionen für BCSE gefunden werden. Diese QTLs lagen auf Chromosom 5 (BTA5) zwischen 17.29 und 47.0 cM und auf Chromosom 18 (BTA18) zwischen 72.01 und 78.84 cM. Mittels des Programmes BLAST konnten die korrespondierenden Genomregionen auf dem aktuellen Genomassembly des Rindes zwischen 14.23 und 35.53 Mb auf BTA5 und zwischen 55.23 und 63.00 Mb auf BTA18 lokalisiert werden. In diesen Genomregionen wurden mit Hilfe vergleichender Kartierung zum Menschen Kandidatengene für BCSE ausgewählt. Die syntäne Region zu BTA5 liegt auf Chromosom 12 (HSA12) des Menschen und die korrespondierende Region von BTA18 auf HSA19. Einerseits untersuchten wir PCR-Produkte von 17 positionellen Kandidatengenen der BCSE-Region auf BTA18 auf SNPs und entwickelten 9 SNPs in 9 Genen. Andererseits wählten wir 349 SNPs aus veröffentlichten Datenbanken aus und genotypisierten diese SNP-Marker. Zusätzlich untersuchten wir die Sequenzen von drei funktionellen Kandidatengenen auf BTA5 (PLXNC1, SOCS2 und KIF21A) und sechs Kandidatengenen auf BTA18 (CPT1C, SYT3, SYT5, TNNT1, RDH13 und TFPT). Innerhalb der fünf Kandidatengene PLXNC1, KIF21A, TNNT1, RDH13 und TFPT fanden wir durch cDNA-Analyse 15 Exon-SNPs und durch genomische Sequenzierung 10 SNPs in Introns. In den codierenden Sequenzen der Gene SOCS2, CPT1C, SYT3, and SYT5 konnten keine Polymorphismen gefunden werden. Mit allen SNPs wurde einer Fall-Kontroll-Studie mittels der Prozedur CASECONTROL von SAS/Genetics durchgeführt. Danach wurde durch Permutation verschiedener Markerkombination die Haplotypenassoziation  berechnet (Prozedur HAPLOTYPE von SAS/Genetics). Auf BTA5, fanden wir zwei SNPs,  die in den c2-Tests für Allel und Genotyp signifikant mit BCSE assoziiert waren. Der ARS-BFGL-NGS-12640 SNP wurde bei 26.49 Mb im intergenischen Bereich gefunden. Der DN825458:c.168G>T SNP lag in Exon 1 des PLXNC1 Gens bei 26.71 Mb. Bei diesem SNP handelt es sich um eine stille Mutation. Durch Permutation verschiedener Markerkombinationen fanden wir auf BTA5 ein Haplotyp, der sich aus den Markern Hapmap42731-BTA-92931, ARS-BFGL-NGS-12640, BTA-73209-no-rs und ARS-BFGL-NGS-49972 zusammensetzte und signifikant mit BCSE assoziiert war. Es konnten vier Einzelhaplotypen mit signifikanter Assoziation zur Gruppe an BCSE erkrankter Tiere (A-G-G-A-G) oder zur Kontrollgruppe gesunder Kühe (G-A-A-C-G, A-G-G-C-C und A-A-A-C-G) gefunden werden. Unter Ausschluß des proximal gelegenen SNPs Hapmap42731-BTA-92931, wies die Kombination der drei SNPs ARS-BFGL-NGS-12640, BTA-73209-no-rs und ARS-BFGL-NGS-49972 eine geringe Irrtumswahrscheinlichkeit (p=0.0006) in der Assoziationsberechnung auf. Daher liegt das für BCSE kausale Gen auf BTA5 mit hoher Wahrscheinlichkeit im Interval zwischen 26.49 Mb und 32.85 Mb. Auf BTA18 erzielte der bei 57.78 Mb gelegene intergenische SNP Hapmap42211-BTA-43910 signifikante Ergebnisse in der Assoziationsstudie. Durch Permutation verschiedener Haplotypen konnte ein signifikant mit BCSE assoziierter Haplotyp zusammengesetzt aus fünf SNPs der Gene CPT1C, SYT5 (synaptotagmin V), RDH13 und NALP7 gefunden werden. Drei individuelle Haplotypen waren signifikant mit BCSE assoziiert. Tiere, die den A-G-C-C-G Haplotyp aufweisen haben ein hohes Risiko an BCSE zu erkranken. Dagegen haben Rinder mit den Haplotypen A-G-A-T-T und G-G-C-C-T ein geringes Risiko BCSE im Laufe ihres Lebens BCSE zu entwickeln. Die für BCSE verantwortliche Genomregion auf BTA18 erstreckt sich von 56,05 Mb bis 63,87 Mb.