Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Differentielle Gentranskription bei infektiösen dritten und in vitro perkutan gewanderten Larven von Ancylostoma caninum

Franke, Daniela Nicole

Ancylostomosis in dogs is a disease mainly found in subtropical and tropical regions and is among others caused by the dog hookworm A. caninum. The third-stage larvae (iL3) of A. caninum represent the infective stage of this parasite which is able to infect potential hosts via different infection routes of which the percutaneous infection seems to be the most important one. Therefore an in vitro model for percutaneous migration had been modified and established. In vitro percutaneously migrated larvae (pgL3) were examined for their food uptake behaviour and were compared to larvae (ssL3) that had been stimulated in another in vitro model, called serumstimulation. With both in vitro models initiation of feeding could be achieved, with differences in the earliest onset of feeding. Afterwards a differential transcriptom analysis of iL3 and pgL3 was performed using the Suppression Subtractive Hybrdidization (SSH) technique. Subtracted cDNA-libraries were produced from the subtracted SSH-products and these libraries were verified by Differential Screening and Virtual Northern Blot. 733 transcripts upregulated in the iL3 and 251 in the pgL3 were detected. 200 of these transcripts per population were sequenced and examined via bioinformatic analysis. This analysis resulted in 22 Contigs and 25 Singletons for the iL3 and 19 Contigs and 37 Singletons for the pgL3. In the iL3 mainly genes with known functions in the osmoregulation in other parasites (p-nitrophenyl-phosphatases, glycerol-3-phosphate-dehydrogenases) were up-regulated. Further-more transcription of genes with relevance to preparation for parasitism or in catabolic (fat-) metabolism was up-regulated. The most up-regulated genes from the pgL3 represent genes with known functions during host-parasite-interactions especially during skin penetration (Ancylostoma-secreted proteins, aspartyl-, metallo- and cysteine-proteases and various heat shock proteins). Furthermore genes involved in regulation processes in the parasite´s energy metabolism were up-regulated, possibly due to the increased motility of the pgL3 during skin penetration. The results of this thesis therefore contribute to a further understanding of the processes on transcript level occuring during skin penetration and so might be regarded as a first step for further investigations that may help to understand the transition from the free-living to the parasitic stage of this parasite.

Die Ancylostomose des Hundes ist eine v. a. in subtropischen und tropischen Regionen vorkommende Erkrankung, die u. a. durch Ancylostoma caninum verursacht wird. Die dritten Larven (iL3) von A. caninum stellen das infektiöse Stadium dieser Art dar, die über verschiedene Infektionswege in ihren potentiellen Wirt eindringen können, wobei der perkutanen Infektion eine besondere Bedeutung zukommt. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit ein in vitro Modell zur perkutanen Infektion modifiziert und etabliert. In vitro perkutan gewanderte Larven (pgL3) wurden hinsichtlich ihres Nahrungsaufnahmeverhaltens untersucht und mit Larven (ssL3), die in einem anderen in vitro Modell, der Serumstimulation, ebenfalls zur Futteraufnahme angeregt wurden, verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass mit beiden Modellen eine Stimulierung der Nahrungsaufnahme erzielt wird, dass jedoch Unterschiede bezüglich des Zeitpunktes, ab dem mit der aktiven Nahrungsaufnahme begonnen wird, bestehen. Anschließend wurden Untersuchungen zur differentiellen Gentrankription zwischen iL3 und pgL3 mit Hilfe der Suppression Subtractive Hybridization (SSH)-Technik vorgenommen. Aus den Produkten der SSH wurden differentielle cDNA-Banken beider Populationen erstellt und mittels Differential Screening und Virtual Northern Blot verifiziert. Insgesamt konnten dabei 733 differentielle Transkripte für die iL3 und 251 für die pgL3 ermittelt werden. Jeweils 200 dieser differentiellen Transkripte wurden sequenziert und einer umfassenden bioinformatischen Analyse unterzogen. Es konnten insgesamt 22 Contigs und 25 Singletons für die iL3 und 19 Contigs und 37 Singletons für die pgL3 ermittelt werden. Bei den iL3 sind v. a. Gene hochreguliert, die für eine Beteiligung an der Osmoregulation bekannt sind (p-Nitrophenyl-Phosphatasen und Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenasen). Des Weiteren werden in den iL3 solche Gene vermehrt transkribiert, die der Vorbereitung auf die parasitische Lebensphase und für katabole (Fett-)Stoffwechselreaktionen der Larven von Bedeutung sind. Bei den pgL3 wurden hingegen v. a. solche Gene identifiziert, die mit Wirt-Parasit-Interaktionen speziell bei der Hautpenetration in Zusammenhang gebracht werden (Ancylostoma-sezernierte Proteine, Aspartyl- Metallo- und Cystein-Proteasen sowie diverse Hitzeschockproteine). Weiteren ermittelten Genen konnte eine Bedeutung im Energiemeta-bolismus der Larven zugeordnet werden, deren verstärkte Transkription vermutlich auf die gesteigerte Motilität der pgL3 bei der Hautwanderung zurückzuführen ist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen zum weiteren Verständnis der Vorgänge auf Transkriptebene in A. caninum bei der Pentetration von Wirtshaut bei und können somit als Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen zum Verständnis des Überganges vom freilebenden zum parasitischen Stadium dieses Parasiten dienen.

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Franke, Daniela Nicole: Differentielle Gentranskription bei infektiösen dritten und in vitro perkutan gewanderten Larven von Ancylostoma caninum. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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