Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Effekte der Aufbereitungstechnik und multipler Einfrier- und Auftauzyklen auf Vitalitätseigenschaften und Chromatinstruktur equiner Spermatozoen

Hagen, Christiane

In preliminary tests the influence of the filling fraction during sperm packaging, and the position of the straws in the freezing chamber on post-thaw spermquality was examined. Spermatozoa stored at the bottom of the freezing automate chamber showed a 4 % higher motility and membrane integrity. The viability of the part of the sperm suspension filled first, was 3 % lower. In Experiment I, 10 Hanoverian Warmblood sires were divided into two groups according to their semen freezability (good and poor freezers). Semen was collected by artificial vagina, centrifuged (10min., 600g), extended in INRA-82 at 400 x 106 spermatozoa/ml and automatically frozen (+5°C → -140°C; 60°C./min). The final glycerol concentration was adjusted to 2.5% in Exp. I. Semen from each stallion was thawed, resuspended in either INRA-82 or Merck-Lactose-Extender at 40 x 106 sperm./ml, filled in 0.5ml straws, and refrozen. These steps were repeated and semen concentration was adjusted to 20 x 106 sperm/ml after a third freezing cycle. The motility, plasmamembrane-, acrosome- and chromatin integrity of spermatozoa after the first, second and third freeze/thaw cycle were assessed by computer-assisted motility analysis (MIKA Motion Analyser) and flow cytometry (FACScan™). Motility, and plasmamembrane integrity (FITC/PNA-Syto-PI-stain) decreased stepwise after first, second and third freezing (29.6% +/-8.64, 14.9% +/-6.38, 8.3% +/-3.24, p≤0.05), whereas the percentage of acrosome-reacted cells increased significantly between each freezing and thawing step (19.5% +/-7.59, 23.9% +/-8.51, 29.2% +/-6.58, p≤0.05). Sperm chromatin integrity did not differ significantly (18.6% +/-6.6, 17.2% +/-6.84, 17.1% +/-7.21, p>0.05). Estrous Hanoverian mares were inseminated with semen of two stallions originating from the first, second or third freeze/thaw cycle. The AI-dose was adjusted to a total of 200 x 106 spermatozoa in an AI-volume of 10 ml. First-cycle pregnancy rates were 4/10, 40 %; 1/10, 10%, and 0/10, 0% after the use of semen frozen/thawed once, twice and three times.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss technologischer Parameter auf den Tiefgefrierprozess und die Auswirkungen mehrfacher Einfrier- und Auftauzyklen auf die Vitalitätseigenschaften, Chromatinstruktur und Befruchtungskapazität equiner Spermatozoen untersucht. In den Vorversuchen konnte der Einfluss der Abfüllfraktion und der Positionierung der Pailletten während der automatisierten Kryokonservierung bestimmt werden. Die im unteren Teil der Gefrierkammer gelagerten Proben zeigten 4 % höhere Auftaumotilitäten als die oben gelagerten und die am Anfang des Abfüllvorgangs abgefüllten Pailletten 3 % schlechtere Auftaumotilitäten. Im Hauptversuch wurden die Auswirkungen multipler Einfrier-Auftauzyklen auf die Motilität, die Plasmamembranintegrität und den Akrosomstatus sowie die Chromatinintegrität untersucht. Zehn Hannoveraner Zuchthengste des Niedersächsischen Landgestüts Celle wurden aufgrund empirisch guter und empirisch schlechter Tiefgefriereignung des Samens in zwei Gruppen aufgeteilt. Jeweils drei Ejakulate wurden mit Hilfe einer künstlichen Scheide gewonnen, zentrifugiert (10min, 600g), auf eine Konzentration von 400 x 106 Spermien/ml mit dem Verdünner INRA-82 verdünnt und mit einer automatisierten Einfriermaschine (+5°C -> -140°C; 60°/min) eingefroren. Die Endkonzentration des Glycerols betrug 2,5 %. Im Anschluss an diese routinemäßige Spermatiefgefrierung wurden die TG-Proben aufgetaut, mit INRA-82- oder Merck-Laktose Verdünner auf 40 x 106 Spermien/ml resuspendiert, in 0,5 ml Pailletten abgefüllt und wieder eingefroren. Die Verfahrensschritte wurden wiederholt und die Spermien in einer Konzentration von 20 x 106 Spermien/ml erneut eingefroren. Die Messung und Beurteilung der Motilität, der Plasmamembranintegrität, des Akrosomenstatus und der Chromatinstruktur der Spermien erfolgte nach dem ersten, zweiten und dritten Einfrier- und Auftauzyklus mit einem computer-assistierten Motionanalyser (MIKA Motion Analyser) und einem Durchflusszytometer (FACScan™). Die Spermienmotilität und die Spermienmembranintegrität (FITC/PNA-Syto®17/PI-Färbung) reduzierte sich nach dem 1., 2., und 3. Einfrier-Auftauzyklus kontinuierlich (62.3% +/-9.35, 24.0% +/-15.42, 3.3% +/-4.34, p≤0.05; 29.6% +/-8.64, 14.9% +/-6.38, 8.3% +/-3.24, p≤0.05), während der prozentuale Anteil an akrosomreagierten Spermien sich signifikant zwischen den einzelnen Einfrier- und Auftauzyklen erhöhte (19.5% +/-7.59, 23.9% +/-8.51, 29.2% +/-6.58, p≤0.05). Die Integrität der Chromatinstruktur der einmal und mehrfach tiefgefrorenen Spermien zeigte keine signifikanten Abweichungen (18.6% +/-6.6, 17.2% +/-6.84, 17.1% +/-7.21, p>0.05). Im anschließenden Besamungsversuch wurden Hannoveranerstuten mit Tiefgefrierspermaproben von 2 Hengsten besamt, die aus dem ersten, zweiten oder dritten Einfrier-Auftauzyklus stammten. Die Inseminationsdosis betrug jeweils 200 x 106Spermatozoen in einem Besamungsvolumen von 10 ml. Die Trächtigkeitsrate nach der ersten Tiefgefrierung betrug 4/10, 40%, nach dem zweiten Einfrier-Auftauzyklus 1/10, 10% und nach dem dritten Einfrierzyklus 0/10, 0%.

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Hagen, Christiane: Effekte der Aufbereitungstechnik und multipler Einfrier- und Auftauzyklen auf Vitalitätseigenschaften und Chromatinstruktur equiner Spermatozoen. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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