Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

In-vitro- und in-situ-Charakterisierung einer Schwann-Zell-ähnlichen Makrogliapopulation im Gehirn adulter Hunde

Imbschweiler, Ilka

In the literature section, a review on neurotrophins and their receptors, with special emphasis on the neurotrophin receptor p75 and its distribution and function in healthy non-neuronal and neuronal tissue, is provided. Additionally, a summary of the in vitro and in situ properties of the currently known glial cells and their precursors is given, including their use in transplantation studies. Finally, there is an introduction to the pathophysiology of demyelinating diseases, such as multiple sclerosis and the relevant animal models, including demyelinating canine distemper encephalitis, Theiler´s murine encephalomyelitis and experimental autoimmune encephalomyelitis. The aim of the present study was to describe the in situ distribution of a novel, p75NTR expressing glial cell population in the healthy and diseased brain of adult dogs and to analyze their in vitro properties after antibody-based purification in comparison to olfactory ensheathing cells (OECs) and Schwann cells. In the in vitro part of the study, brain, olfactory bulb and sciatic nerve of young-adult dogs were treated with enzymes and dissociated mechanically into single cells. Purification of p75NTR-expressing cells was done by means of magnet-activated cell sorting. Fibroblasts from subcutaneous tissue negative for p75NTR served as a control. The different cell types were comparatively analyzed in vitro with regard to morphology, growth factor responsiveness or proliferation and antigen expression. SCBG differed from both OECs and Schwann cells by a significantly lowered GFAP expression. The expression of A2B5 and O4 was significantly higher in SCBG and OECs compared to Schwann cells. The glial cells shared the proliferative response to fetal calf serum and FGF-2 with fibroblasts, while HRG-1ß promoted proliferation of glial cells but not of fibroblasts. All glial cells displayed a spindle-shaped, bi- to tripolar morphology, which was clearly different form the flattened morphology of the fibroblasts. In the in situ part, formalin-fixed and paraffin-embedded brain tissue from healthy and CNS-diseased dogs was used. Sections were stained with hematoxylin/eosin and luxol fast blue cresyl echt violet to reveal the degree of demyelination. Immunohistologically, the distribution of cells positive for the neurotrophin receptor p75 was investigated and compared to the distribution of other glial and neuronal cells. The dogs were classified in four different investigation groups (UG): Healthy controls (UG1), dogs with canine distemper virus-induced alterations (UG2), dogs with other CNS alterations (UG3) and old dogs with and without diffuse plaques (UG4). Additionally, the lesions in the cerebella of dogs suffering from demyelinating canine distemper encephalitis were classified in 7 groups according to the histological diagnosis: controls (group 1), normal appearing white matter (group 2), animals with areas lacking microscopical lesions but displaying CDV antigen-immunoreactivity (group 3), acute lesions (group 4), subacute lesions without inflammation (group 5), subacute lesions with inflammation (group 6) and chronic plaques (group 7). In the brains of all investigation groups, p75NTR was detected in the perivascular connective tissue of the leptomeninx and perineuronally in the nuclei and fiber tracts of the trigeminal nerve. Dogs with canine distemper showed an additional graded positive reaction in group 4 to 7. On the cellular level, three morphologically distinct p75NTR positive phenotypes were identified. Type A cells displayed a thin and bipolar appearance with a maximum cell body width of 5 µm, while type B cells were also bipolar but larger in size (10 µm). Type C cells were up 10 to 20 µm big and displayed a multipolar morphology resembling microglia. There was no correlation between the cells´ morphology and the type of lesion. Additionally, a fibrillary and fibrous reaction product without detection of nuclei was found within the lesions. This was interpreted as positive reaction of cellular processes. In the subacute lesions with inflammation (group 6), the number of p75NTR positive cells was significantly increased compared to the other groups with lesion and presence of CDV antigen (group 4, 5 and 7). The positive reaction was present throughout the entire lesion and included all 3 described morphological phenotypes. The chronic plaques (group 7) contained only single p75NTR-positive cells. There was a positive correlation between the number of p75NTR positive cells and the number of CDV antigen-positive cells within the lesions. The additional analysis of OCT-embedded cerebella of CDV-diseased dogs revealed no cellular co-localisation of p75NTR and GFAP. In UG3, p75NTR positive cells with the above described morphology were only detected in dogs with demyelinating lesions. In the cerebrum of old dogs of UG4, p75NTRimmunoreactivity was found independently of plaques in the cytoplasm of presumably cholinergic neurons of the septal nucleus and the Putamen. In the present study, an increased expression of p75NTR in brains of dogs with demyelinating diseases could be demonstrated. The expression of p75NTR was associated in situ with three morphological different phenotypes. The observation that similar results were reported in multiple sclerosis brains together with the fact that p75NTR-expressing cells were also found in non-virally-induced demyelinating lesions may indicate that the emergence of this cell type is secondary to virus infection and may represent a general phenomenon related to the reaction of the organism to demyelination. In multiple sclerosis lesions these cells are interpreted as glial precursor cells. Studies in rodents have provided substantial evidence that Schwann cell-like cells can arise from central precursor cells following demyelination of the spinal cord. In the present study glial cells with Schwann cell-like properties (SCBG) could be isolated from the brain of adult dogs. These cells displayed a morphology comparable to p75NTR-positive type A and B cells detected in situ. In vitro, the cells showed pronounced similarity to Schwann cells and OECs, but differed significantly in the expression of several antigens. Further studies have to clarify the relationship between p75NTR-positive cells detected in demyelinating diseases in situ and the in vitro characterized SCBG.

Die Literaturübersicht der vorgelegten Arbeit enthält neben einer Übersicht zu Neurotrophinen und ihren Rezeptoren eine ausführliche Beschreibung des Neurotrophin-Rezeptor p75, dessen Verteilung und Funktion im gesunden nicht-neuronalen und neuronalen Gewebe dargestellt wird. Darüber hinaus erfolgt eine zusammenfassende Charakterisierung der in vitro und in vivo Eigenschaften heutzutage bekannter Gliazellen und glialer Vorläuferzellen inklusive ihrer Verwendung in Transplantationsstudien. Abschließend wird die Pathophysiologie demyelinisierender Erkrankungen am Beispiel der Multiplen Sklerose erläutert und die hierfür relevanten Tiermodelle wie zum Beispiel die demyelinisierende Staupeenzephalitis, die Theilervirus-Enzephalomyelitis (TME) und die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) vorgestellt. Ziel der Studie war es, die Verteilung einer neuartigen, durch Expression des Neurotrophinrezeptors p75 gekennzeichneten Gliapopulation im gesunden und erkrankten Gehirn adulter Hunde zu beschreiben und ihre in vitro Eigenschaften nach Antikörper-gestützter Reinigung vergleichend mit olfaktorischen Hüllzellen („olfactory ensheathing cells“, OECs) und Schwann-Zellen zu analysieren. Für den in vitro Teil wurden Gehirn, Bulbus olfactorius und Nervus ischiadicus frisch toter, jung adulter Hunde enzymatisch-mechanisch in Einzelzellen dissoziiert und p75NTR-exprimierende Zellen mittels „magnet-activated cell sorting“ gereinigt. Als Kontrollkultur wurden p75NTR-negative Fibroblasten aus der Unterhaut jung adulter Hunde gewonnen. Zunächst erfolgte die vergleichende Charakterisierung der verschiedenen Zelltypen hinsichtlich Morphologie, Wachstumsfaktor-Responsivität bzw. Proliferation und Antigenexpression. SCBG unterschieden sich hierbei von OECs und Schwann-Zellen durch eine im Vergleich signifikant niedrigere Expression von GFAP. Die Expression von A2B5 und O4 war in SCBG und OECs signifikant höher als in Schwann-Zellen. Alle Zellen zeigten erhöhte Proliferation in der Gegenwart von Serum und FGF-2. Anders als Fibroblasten zeigten alle drei glialen Populationen verstärkte Proliferation nach Gabe von HRG-1ß. Die glialen Zellen besaßen dabei ohne Ausnahme einen bi- bis tripolaren spindelförmigen Phänotyp, der sich deutlich von dem der flächig ausgebreiteten Fibroblasten unterschied. Für den in situ Teil wurde Formalin-fixiertes und Paraffin-eingebettetes Gehirngewebe gesunder und ZNS-erkrankter Hunde verwendet. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin (HE)- und Luxol Fast Blue-Kresylechtviolett (LFB-KEV) zur Darstellung des Demyelinisierungsgrades gefärbt. In der Immunhistologie wurde die Verteilung von p75NTR positiven Zellen untersucht und mit der Verteilung von glialen und neuronalen Zellen verglichen. Die Hunde wurden in vier verschiedene Untersuchungsgruppen (UG) eingeteilt: gesunde Kontrolltiere (UG1), Hunde mit Staupevirus-induzierten Veränderungen (UG2), Hunde mit anderen ZNS-Veränderungen (UG3) und alte Hunde mit und ohne diffuse Plaques (UG4). Die Kleinhirnläsionen der an einer demyelinisierenden Staupeenzephalitis erkrankten Hunde wurden darüber hinaus anhand ihres histologischen Erscheinungsbildes sowie des immunhistologischen Nachweises von Staupevirus-Nukleoproteinantigen in 7 Gruppen eingeteilt Hierbei entsprachen die Kontrolltiere der Gruppe 1, die “normal appearing white matter“ der Gruppe 2, Antigennachweis ohne offensichtliche Läsion der Gruppe 3, Antigennachweis und akute Läsion der Gruppe 4, Antigennachweis und subakute Läsionen ohne Entzündung der Gruppe 5, Antigennachweis und subakute Herde mit Entzündung der Gruppe 6 und Antigennachweis und chronische Läsion der Gruppe 7. In den Gehirnen aller Untersuchungsgruppen wurde p75NTR immunhistologisch im perivaskulären Bindegewebe der Leptomeninx und perineuronal in den Kerngebieten und Faserbahnen des Nervus trigeminus nachgewiesen. Bei den an Staupevirus erkrankten Hunden der UG2 fand sich zudem eine positive, unterschiedlich ausgeprägte Reaktion in den Gruppen 4 bis 7. Auf zellulärer Ebene wurden drei morphologisch verschiedene p75NTR-positive Phänotypen identifiziert. Hier als Typ A bezeichnete Zellen waren schmal und bipolar mit einer maximalen Breite von ca. 5 µm, während Typ B-Zellen ebenfalls bipolare Gestalt besaßen, aber mit 10 µm deutlich breiter waren. Typ C-Zellen waren multipolar, 10-20 µm groß und ähnelten morphologisch mikroglialen Zellen. Es fand sich kein Zusammenhang zwischen der Morphologie p75NTR-positiver Zellen und der Art der Läsion. Zusätzlich wurde in den Herden eine zum Teil fibrilläre und faserförmige positive Reaktion ohne Nachweis von Kernen beobachtet, die als positive Reaktion im Bereich von Zellausläufern interpretiert wurde. In den subakuten Läsionen mit Entzündung und Staupevirus-Antigennachweis (Gruppe 6) fand sich eine im Vergleich zu den anderen Läsionen mit Antigennachweis (Gruppe 4, 5 und 7) statistisch signifikant erhöhte Anzahl p75NTR-positiver Zellen. Das Signal war hierbei in der gesamten Läsion nachweisbar und schloss alle drei beschriebenen Phänotypen ein. In den chronischen Herden (Gruppe 7) waren die p75NTR-positiven Zellen nur noch vereinzelt nachweisbar. Die Anzahl p75NTR-positiver Zellen korrelierte positiv mit der Anzahl Staupevirus-Antigen positiver Zellen in den Läsionen. Die zusätzliche Analyse OCT-eingebetteter Kleinhirnproben Staupe-kranker Hunde ergab auf zellulärer Ebene keine Hinweise auf eine Ko-kolalisation von p75NTR und GFAP. In der UG3 fanden sich nur bei Hunden mit demyelinisierenden Veränderungen p75NTR positive Zellen mit der gleichen Morphologie, wie sie bei den an Staupevirus erkrankten Hunden beschrieben wurden. In der UG4 fand sich im Großhirn von alten Hunden unabhängig von dem Vorhandensein von Plaques in vermutlich cholinergen Neuronen des Nucleus septalis und des Putamen ein positives, zytoplasmatisches Signal für p75NTR. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass p75NTR in Gehirnen von Hunden mit demyelinisierenden Erkrankungen verstärkt exprimiert wird und in situ mit drei unterschiedlichen morphologischen Phänotypen assoziiert ist. Die Beobachtung, dass im Gehirn bei Multipler Sklerose vergleichbare Befunde erhoben werden zusammen mit der Tatsache, dass p75NTR-exprimierende Zellen auch in nicht Virus-induzierten demyelinisierenden Läsionen auftreten, ist ein Hinweis darauf, dass das Auftreten dieses Zelltyps eine sekundäre Reaktion auf eine Virusinfektion und eine generelle Antwort des Organismus auf Demyelinisierung ist. Bei der Multiplen Sklerose werden diese Zellen als gliale Vorläuferzellen interpretiert. Aus Studien bei Nagern ist bekannt, dass sich Schwann-Zell-ähnliche Zellen bei demyelinisierenden Läsionen im Rückenmark aus zentralen Vorläuferzellen entwickeln können. In der vorliegenden Arbeit konnten gliale Zellen mit Schwann-Zell-ähnlichen Eigenschaften (SCBG) aus dem Gehirn adulter Hunde isoliert werden. Diese Zellen wiesen eine Morphologie auf, die den in situ beobachteten p75NTR-positiven Typ A und B Zellen entsprach. In vitro zeigten die Zellen zudem große Ähnlichkeit mit Schwann-Zellen und OECs, unterschieden sich jedoch signifikant in der Expression verschiedener Antigene. Es bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten, eine mögliche Assoziation zwischen den in situ bei demyelinisierenden Erkrankungen nachgewiesenen p75NTR-positiven Zellen und den in vitro charakterisierten SCBG zu klären.

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Imbschweiler, Ilka: In-vitro- und in-situ-Charakterisierung einer Schwann-Zell-ähnlichen Makrogliapopulation im Gehirn adulter Hunde. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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