Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Durchflusszytometrische und computervideomikrographische Untersuchungen zur Kapazitation, Akrosomreaktion und Chromatinintegrität equiner Spermatozoen

Klewitz, Jutta

The aim of this study was to evaluate stallion semen by flow cytometrical and computervideomicrographic evaluation with regard to plasma membrane integrity, arosomal status, chromatin integrity and motility. This first experiment was designed to evaluate capacitation and acrosome reaction and to examine to which extend the test results give evidence to fertility prediction of the breeding stallion. Three ejaculates of 41 stallions of the State Stud of Lower Saxony were extended in skim milk-extender (INRA 82) and flowcytometrically analyzed with regard to capacitation status and stimulation of capacitation by bicarbonate which is considered to be a physiological inducer of capacitation in the female reproductive tract. Furthermore the effects of Ca-Ionophore A 23187 and progesterone as non-physiological and physiological inducers of the acrosome reaction were evaluated. The percentage of vital capacitated (YoPro- / Merocyanin540+ -stained) sperm in bicarbonate-free Tyrode-medium was 8,4 ± 5,1% at the day of semen collection and increased 3,5 times after incubation in Tyrodemedium containing bicarbonate (15 mM). After 24 hours cooled storage at +5°C 15,3 ± 7,8 % showed capacitation-like changes and no significant increase in the stimulation of capacitation was observed over all stallions. Due to the observation that stallions with good fertility prospect had significant higher levels of vital capacitated sperm in Tyrode medium containing bicarbonate, stimulation of capacitation is considered to be a useful parameter for fertility prognosis. After incubation (+37°C) with Calcium-Ionophore A 23187 (final concentration: 5 µM) or progesterone (final concentration: 3,18 µM) a significant increase in the number of sperm with positive acrosomal status (PAS) was observed at the day of semen collection and after cooled storage. Whereas induction of the acrosome reaction by the non-physiological inducer Calcium-Ionophore significantly correlated with the Non-Return-Rate 33 (r = 0,49; p ≤ 0,05), there was no correlation between the induction rate by progesterone and fertility. The second experiment with eight stallions was designed to evaluate the effect of extender (INRA 96, Andromed®E, EquiPro™ und ESE), centrifugation and cooled storage on motility, plasma membrane integrity, acrosomale status and chromatin integrity of stallion sperm. At the day of semen collection extended and centrifuged INRA 96- and extended ESE-samples showed a significant lower number of sperm with positive acrosomal status. In contrast to the expected membrane-stabilising effect of ESE extender containing antioxidants, a significant increase of acrosome reacted sperm were observed in ESE during cooled storage at 5°C for 96 hours. Furthermore, evaluation of chromatin integrity during storage was suggested a valuable fertility parameter due to the significant increase in DFI-values, only observed in extended semen samples of stallions with low fertility. Within the computervideomicrographic analysis the simultanous evaluation of motility and viability by the CASA-system SpermVision™ was examined as a practical method of semen evaluation. Computer-assisted viability considerably correlated with plasmamembrane integrity estimated by flowcytometry (r = 0,73; p ≤ 0,001) and can be considered as a quick and reasonable method of objective semen evaluation at AI-centres.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Hengstsperma mittels durchflusszytometrischer und computervideomikrographischer Untersuchungen im Hinblick auf die Plasmamembranintegrität, den akrosomalen Status, die Chromatinintegrität und die Motilität zu untersuchen. Im ersten Versuchsteil wurde der Schwerpunkt auf die Untersuchung der Kapazitation und Akrosomreaktion gelegt und überprüft, inwieweit die ermittelten Testergebnisse eine Aussage über die Befruchtungsleistung des Hengstes zulassen. Anhand von drei in Magermilchverdünner (INRA 82) aufbereiteten Samenproben von 41 Hengsten des Niedersächsischen Landgestüts Celle wurden der Kapaziationsstatus der Spermien und die Auslösung der Kapazitation durch Bikarbonat untersucht, das als physiologischer Induktor der Kapazitation im weiblichen Genitaltrakt angesehen wird. Des Weiteren wurde die Eignung des nicht-physiologischen Induktors Ca-Ionophor A 23187 und des physiologischen Induktors Progesteron zur in vitro-Induktion der Akrosomreaktion getestet. Am Tag der Samengewinnung betrug der Anteil lebend kapazitierter (YoPro- / Merocyanin540+ - gefärbter) Spermien im bikarbonatfreien Tyrodemedium 8,4 ± 5,1% und stieg nach Inkubation in bikarbonathaltigem Tyrodemedium (15 mM) um das 3,5-fache an. Nach 24-stündiger gekühlter Lagerung bei +5°C zeigten 15,3 % der Spermien bereits kapazitations ähnliche Veränderungen und im Mittel der Hengste wurde keine signifikante Stimulierbarkeit der Kapazitation durch Bikarbonat beobachtet. Da Hengste mit guter Fruchtbarkeitsleistung jedoch signifikant höhere Anteile lebend kapazitierter Spermien in bikarbonathaltigem Medium als schlecht befruchtende Hengste zeigten, wird die Kapazitationsfähigkeit nach 24-stündiger Lagerung als wertvoller Fertilitätsparameter gewertet.Nach Inkubation (+37°C) mit Calcium-Ionophor A 23187 (Endkonzentration: 5 µM) oder Progesteron (Endkonzentration: 3,18 µM) wurde an beiden Untersuchungszeitpunkten ein signifikanter Anstieg des Spermienanteils mit positivem akrosomalen Status (PAS) beobachtet. Während die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion durch den nicht-physiologischen Induktor Calcium-Ionophor signifikant mit der Non-Return-Rate 33 der Hengste korrelierte (r = 0,49; p ≤ 0,05), konnte keine Korrelation zwischen der Induzierbarkeit durch Progesteron und der Fertilität ermittelt werden. Im zweiten Versuch wurden bei acht Hengsten der Einfluss des Verdünners (INRA 96, Andromed®E, EquiPro™ und ESE), der Aufbereitung und der Lagerungsdauer auf die Motilität, Plasmamembranintegrität, den akrosomalen Status und die Chromatinintegrität von Hengstspermien ermittelt. Am Tag der Samengewinnung zeigten die verdünnten und zentrifugierten INRA 96 und die verdünnten ESE-Samenproben einen signifikant geringeren Anteil Spermien mit positivem akrosomalen Status. Trotz des erwarteten membranstabilisierenden Effekts durch die im Verdünner ESE enthaltenden Antioxidantien wurde im Verlauf der 96-stündigen Lagerung bei +5°C ein signifikanter Anstieg akrosomreagierter Spermien festgestellt. Als wertvoller Fertilitätsparameter wurde die Untersuchung der Chromatinintegrität im Verlauf der Lagerung gewertet, da nur bei Hengsten mit geringerer Befruchtungsleistung ein signifikanter Anstieg der DFI-Werte in den verdünnten Samenproben beobachtet wurde. Im Rahmen der computervideomikrographischen Analyse wurde zudem die simultane Motilitäts- und Viabilitätsbestimmung mit Hilfe des CASA-Systems SpermVision™ als praxistaugliche Methode der Spermaqualitätsbeurteilung evaluiert. Die computervideomikrographisch bestimmte Viabilität korrelierte deutlich mit der durchflusszytometrisch ermittelten Plasmamembranintegrität r = 0,73 (p ≤ 0,001) und eignet sich als eine praxistaugliche, schnelle und kostengünstige Methode der objektiven Spermaqualitätsbeurteilung auf Besamungsstationen.

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Klewitz, Jutta: Durchflusszytometrische und computervideomikrographische Untersuchungen zur Kapazitation, Akrosomreaktion und Chromatinintegrität equiner Spermatozoen. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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