Durchflusszytometrische und computervideomikrographische Untersuchungen zur Kapazitation, Akrosomreaktion und Chromatinintegrität equiner Spermatozoen

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Hengstsperma mittels durchflusszytometrischer und computervideomikrographischer Untersuchungen im Hinblick auf die Plasmamembranintegrität, den akrosomalen Status, die Chromatinintegrität und die Motilität zu untersuchen. Im ersten Versuchsteil wurde der Schwerpunkt auf die Untersuchung der Kapazitation und Akrosomreaktion gelegt und überprüft, inwieweit die ermittelten Testergebnisse eine Aussage über die Befruchtungsleistung des Hengstes zulassen. Anhand von drei in Magermilchverdünner (INRA 82) aufbereiteten Samenproben von 41 Hengsten des Niedersächsischen Landgestüts Celle wurden der Kapaziationsstatus der Spermien und die Auslösung der Kapazitation durch Bikarbonat untersucht, das als physiologischer Induktor der Kapazitation im weiblichen Genitaltrakt angesehen wird. Des Weiteren wurde die Eignung des nicht-physiologischen Induktors Ca-Ionophor A 23187 und des physiologischen Induktors Progesteron zur in vitro-Induktion der Akrosomreaktion getestet. Am Tag der Samengewinnung betrug der Anteil lebend kapazitierter (YoPro- / Merocyanin540+ - gefärbter) Spermien im bikarbonatfreien Tyrodemedium 8,4 ± 5,1% und stieg nach Inkubation in bikarbonathaltigem Tyrodemedium (15 mM) um das 3,5-fache an. Nach 24-stündiger gekühlter Lagerung bei +5°C zeigten 15,3 % der Spermien bereits kapazitations ähnliche Veränderungen und im Mittel der Hengste wurde keine signifikante Stimulierbarkeit der Kapazitation durch Bikarbonat beobachtet. Da Hengste mit guter Fruchtbarkeitsleistung jedoch signifikant höhere Anteile lebend kapazitierter Spermien in bikarbonathaltigem Medium als schlecht befruchtende Hengste zeigten, wird die Kapazitationsfähigkeit nach 24-stündiger Lagerung als wertvoller Fertilitätsparameter gewertet.Nach Inkubation (+37°C) mit Calcium-Ionophor A 23187 (Endkonzentration: 5 µM) oder Progesteron (Endkonzentration: 3,18 µM) wurde an beiden Untersuchungszeitpunkten ein signifikanter Anstieg des Spermienanteils mit positivem akrosomalen Status (PAS) beobachtet. Während die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion durch den nicht-physiologischen Induktor Calcium-Ionophor signifikant mit der Non-Return-Rate 33 der Hengste korrelierte (r = 0,49; p ≤ 0,05), konnte keine Korrelation zwischen der Induzierbarkeit durch Progesteron und der Fertilität ermittelt werden. Im zweiten Versuch wurden bei acht Hengsten der Einfluss des Verdünners (INRA 96, Andromed®E, EquiPro™ und ESE), der Aufbereitung und der Lagerungsdauer auf die Motilität, Plasmamembranintegrität, den akrosomalen Status und die Chromatinintegrität von Hengstspermien ermittelt. Am Tag der Samengewinnung zeigten die verdünnten und zentrifugierten INRA 96 und die verdünnten ESE-Samenproben einen signifikant geringeren Anteil Spermien mit positivem akrosomalen Status. Trotz des erwarteten membranstabilisierenden Effekts durch die im Verdünner ESE enthaltenden Antioxidantien wurde im Verlauf der 96-stündigen Lagerung bei +5°C ein signifikanter Anstieg akrosomreagierter Spermien festgestellt. Als wertvoller Fertilitätsparameter wurde die Untersuchung der Chromatinintegrität im Verlauf der Lagerung gewertet, da nur bei Hengsten mit geringerer Befruchtungsleistung ein signifikanter Anstieg der DFI-Werte in den verdünnten Samenproben beobachtet wurde. Im Rahmen der computervideomikrographischen Analyse wurde zudem die simultane Motilitäts- und Viabilitätsbestimmung mit Hilfe des CASA-Systems SpermVision™ als praxistaugliche Methode der Spermaqualitätsbeurteilung evaluiert. Die computervideomikrographisch bestimmte Viabilität korrelierte deutlich mit der durchflusszytometrisch ermittelten Plasmamembranintegrität r = 0,73 (p ≤ 0,001) und eignet sich als eine praxistaugliche, schnelle und kostengünstige Methode der objektiven Spermaqualitätsbeurteilung auf Besamungsstationen.