Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Fine mapping of quantitative trait loci (QTL) for osteochondrosis in Hanoverian warmblood horses

Lampe, Virginie

The objective of this study was to refine quantitative trait loci (QTL) for osteochondrosis (OC) in Hanoverian warmblood horses in order to identify candidate genes with influence on the development of OC. From a high number of QTL identified in a previous whole genome scan, genome-wide significant QTL located on ECA5 and ECA16 and a chromosome-wide significant QTL located on ECA21 were chosen for further fine mapping. The release of the horse genome assembly EquCab2 made it possible to develop new microsatellites which enabled a decrease of the marker distances in QTL regions of less than 1 Mb. Microsatellites were genotyped for 104 progeny of 14 paternal half-sib families of Hanoverian warmblood horses, their dams and eight sires. Data was analysed using non-parametric linkage analysis based on identical by descent (IBD) mapping. Traits used were OC (fetlock and/or hock joints affected), OCD (fetlock and/or hock joints affected), fetlock OC, fetlock OCD, hock OC and hock OCD. On ECA5, a total of 49 new microsatellites were used, which could narrow down the QTL for fetlock OCD to an interval at 76.69 to 92.77 Mb. For fetlock OC, the QTL could be refined to a region from 79.65 to 89.31 Mb. On ECA16, altogether 56 microsatellites and 15 SNPs were genotyped in order to refine the putative QTL. The analysis revealed a delimitation of the QTL for hock OCD to an interval between 17.60 and 45.80 Mb. The QTL for fetlock OC could be narrowed down to a region from 6.55 to 24.26 Mb. Furthermore, the analysis revealed a QTL for OC in fetlock and/or hock joints at 14.38 Mb and in the region from 12.10 to 24.26 Mb for OCD in fetlock and/or hock joints. The refinement of the QTL on ECA21 using 22 microsatellites allowed a verification of the QTL for hock OC and hock OCD at 5.45 to 17.14 Mb. On ECA18, a new QTL for osteochondrosis in fetlock and/or hock joints could be detected between 74.94 and 82.25 Mb after increasing the marker density from seven microsatellites in the whole genome scan to a total of 27 markers. Due to the availability of an equine SNP chip, which assays ~50,000 SNPs simultaneously, a whole genome association analysis was performed with 154 unrelated Hanoverian warmblood horses. Focussing on the refined QTL on ECA5, 16, 18 and 21, single marker and haplotype association was performed for SNPs being located in the QTL and nearby. Haplotype association of SNPs could narrow down the genomic regions to intervals between 76.79 and 81.10 Mb on ECA5, between 17.57 and 20.1 Mb on ECA16 for the QTL for hock OCD, between 79.36 and 80.84 Mb on ECA18 and between 8.97 and 16.18 Mb on ECA21. Furthermore, six QTL on ECA1, 4, 14, 16, 18 and 30 were detected for the trait OC in fetlock and/or hock joints and four QTL for OCD in fetlock and/or hock joints on ECA1, 3, 30 and X. For the trait OC in fetlock joints, five different QTL on ECA2, 16, 26, 30 and X were identified, for the trait OCD in fetlock joints five QTL were observed on ECA2, 3, 13, 22 and 30. For hock OC five QTL were discovered being significant on ECA1, 4, 14, 29 and 30, for hock OCD three QTL were identified on ECA1, 6 and 30. The refinement and identification of QTL was a first step towards the discovery of genes responsible for equine osteochondrosis. It is unlikely that any of the SNP found associated with osteochondrosis represent causal mutations, as most of them are located in intergenic regions. In order to develop a marker test, significant associated SNPs should be verified in a large sample of horses.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war eine Feinkartierung von quantitativen Merkmalsgenorten, welche Gene beherbergen, die einen Einfluss auf die Entwicklung der Osteochondrose beim Hannoverschen Warmblutpferd haben. In einer früheren Studie beim Hannoverschen Warmblut wurden bereits zahlreiche Quantitative Trait Loci (QTL) für Osteochondrose identifiziert. Daraus wurden zunächst genomweit signifikante QTL auf den Pferdechromosomen (ECA) 5 und 16, sowie ein chromosomweit signifikanter QTL auf ECA21 zur weiteren Feinkartierung ausgewählt. Die Veröffentlichung des Pferdegenoms EquCab2 machte die Entwicklung neuer Mikrosatelliten möglich, wodurch eine Markerdichte in den QTL Regionen von unter einer Megabase erzielt werden konnte. Diese Mikrosatelliten wurden an 14 väterlichen Halbgeschwisterfamilien genotypisiert, welche sich aus 104 Fohlen, 99 Müttern und acht Hengsten zusammensetzten. Eine nicht-parametrische Kopplungsanalyse wurde unter Verwendung der Software MERLIN durchgeführt und basierte auf dem „identical-by-descent“ (IBD) Verfahren. Für die Merkmale OC, OCD, OC im Fesselgelenk, OCD im Fesselgelenk, OC im Sprunggelenk und OCD im Sprunggelenk wurden getrennte Berechnungen durchgeführt. Auf ECA5 wurden insgesamt 49 Mikrosatelliten genotypisiert, wodurch eine Eingrenzung des QTL für OCD im Fesselgelenk auf ein Interval von 76.69 bis 92.77 Mb erzielt werden konnte. Auch für das Merkmal OC im Fesselgelenk konnte der QTL auf einen Bereich zwischen 79.65 und 89.31 Mb eingegrenzt werden. Zur Feinkartierung der genomischen Region auf ECA16 wurden insgesamt 56 Mikrosatelliten und 15 SNPs typisiert. Die nicht-parametrische Kopplungsanalyse erbrachte QTL für OC bei 14.38 Mb und für OCD zwischen 12.10 und 24.26 Mb. Außerdem konnte der QTL für Fesselgelenks-OC auf einen Bereich von 6.55 bis 24.26 Mb und der QTL für Sprunggelenks-OCD auf 17.60 bis 45.80 Mb eingegrenzt werden. Auf ECA21 konnte durch die Genotypisierung von insgesamt 22 Mikrosatelliten eine Eingrenzung der QTL für Sprunggelenks-OC, sowie Sprunggelenks-OCD zwischen 5.45 und 17.14 Mb erfolgen. Auf ECA18 wurde die Markerdichte von sieben Mikrosatelliten im Genomscan auf 27 Mikrosatelliten erhöht. Dadurch konnte ein bisher nicht bekannter QTL für OC in Fessel- und/oder Sprunggelenken in einer Region zwischen 74.94 und 82.25 Mb aufgedeckt werden. Mit einem seit 2008 kommerziell erhältlichen SNP-Chip wurden ~50.000 einzelne SNPs in einem Arbeitsschritt durch ein automatisiertes Verfahren an 154 unverwandten Hannoverschen Warmblutpferden genotypisiert, mit dem Ziel, eine genomweite Assoziationsanalyse durchzuführen. In den QTL auf den Chromosomen 5, 16, 18 und 21 wurden eine große Anzahl assoziierter SNPs gefunden. Daraus konstruierte Haplotypen konnten daraufhin die einzelnen QTL auf Intervalle zwischen 76.79 und 81.10 Mb auf ECA5, zwischen 17.57 und 20.1 Mb auf ECA16 für den QTL für Sprunggelenks-OCD, zwischen 79.36 und 80.84 Mb auf ECA18 und zwischen 8.97 und 16.18 Mb auf ECA21 weiter eingrenzen. Zusätzlich konnten sechs potentielle neue QTL auf ECA1, 4, 14, 16, 18 und 30 für das Merkmal OC in Fessel- und/oder Sprunggelenken und vier QTL für OCD in Fessel- und/oder Sprunggelenken auf den Chromosomen 1, 3, 30 und X ermittelt werden. Für Fesselgelenks-OC wurden fünf neue QTL auf den Chromosomen 2, 16, 26, 30 und X und für Fesselgelenks-OCD ebenfalls fünf QTL auf ECA2, 3, 13, 22 und 30 nachgewiesen. Fünf QTL auf den Chromosomen 1, 4, 14, 29 und 30 für OC in Sprunggelenken, sowie drei signifikante genomische Regionen für Sprunggelenks-OCD auf ECA1, 6 und 30 konnten außerdem neu identifiziert werden. Die Feinkartierung und Identifizierung von QTL für Osteochondrose ist ein großer Schritt in Richtung der Aufdeckung von Genen, welche an der Entstehung dieser Erkrankung beim Pferd beteiligt sind. Es ist allerdings unwahrscheinlich, dass die mit Osteochondrose assoziierten SNPs kausale Mutationen darstellen, da die meisten SNPs intergenisch lokalisiert sind. Um einen Markertest entwickeln zu können, sollten signifikant assoziierte SNPs an einer großen Anzahl weiterer Pferde verifiziert werden.

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Lampe, Virginie: Fine mapping of quantitative trait loci (QTL) for osteochondrosis in Hanoverian warmblood horses. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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