Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Identification and molecular characterization of immunogenic antigens in Mycoplasma mycoides subsp. mucoides small colony type

Naseem, Shamoon

Contagious Bovine Pleuropneumonia (CBPP) caused by Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) is one of the economically most important diseases of cattle in large parts of sub-saharan Africa, and there is an increasing threat of re-introducing the disease into other parts of the world. The pathogenicity of CBPP is poorly understood, and diagnostic tests available are applicable at the herd level but are of limited use for individual testing. Currently used vaccines do not protect reliably against infection and can cause severe side effects. The identification of previously unknown immunogenic proteins is a prerequisite for the development of novel diagnostic tests and vaccines. In order to achieve this goal a phage M13-based display method based on the helperphage “Hyperphage” was used. To construct the MmmSC expression library genomic DNA was restricted with five different restriction endonucleases resulting in blunt ends. DNA fragments of 200 to 800 bp were isolated and ligated into the vector pHORF3 and two derivatives constructed in this work. The library was packaged into “Hyperphage” and screened by panning using an anti-MmmSC serum obtained by pooling the sera of 10 individual CBPP-positive animals. After four panning rounds 147 individual phage clones were sequenced resulting in the identification of 22 different immunogenic MmmSC proteins some of which have been described as immunogenic or as being involved in virulence. In order to identify the clones potentially best suited as antigen in a diagnostic ELISA an ELISA-based selection was performed. Initially the eight clones resulting in the highest ELISA titre with the positive control sera were selected. These were tested for their discriminatory power comparing positive and negative control sera. Six clones resulting in an at least 4-fold difference in titre were tested with 10 individual positive sera. Four clones encoding epitopes of acyl carrier protein phosphodiesterase (MSC_029), glycosyl transferase (MSC_108), conserved hypothetical protein (MSC_636) and AAA family ATPase (MSC_1062) were highly positive with all sera; they were tested for reactivity with rabbit sera against 17 other mycoplasmal species. One clone (AAA family ATPase MSC_1062) showed strong cross reactivity with the serum directed against M. canadense. Three clones (MSC_029, MSC_108 and MSC_636) did not show significant cross reactivity. In order to facilitate efficient production of these three antigens the immunoreactive epitopes were expressed as GST fusion proteins. The part of the respective gene encoding the immunogenic peptide, located between two TGA-codons, was amplified by PCR using primers with a unique restriction enzyme site on their respective 5’-ends in order to facilitate directional cloning into the expression vector pGEX5x-2. Fusion proteins were prepared as inclusion bodies and shown to be immunoreactive and specific in Western blot analyses using the bovine positive control serum and in an ELISA using rabbit hyperimmune serum. However, an ELISA using the bovine positive and negative control serum showed a strong reactivity also with negative serum as well as a high inter-assay variation and did not allow a significant discrimination between positive and negative serum. Therefore, the immunogenic antigens identified are potentially valuable for the development of new diagnostic tests and/or vaccines but additional work will be required to transfer their use into practical application.

Die durch Mycoplasma mycoides subspecies mycoides small colony type (MmmSC) ausgelöste Lungenseuche ist eine der wirtschaftlich verlustreichsten Rindererkrankung in vielen Teilen von Afrika südlich der Sahara und es besteht eine erhöhte Gefahr der Wiedereinschleppung in andere Teile der Welt. Die Pathogenität der Lungenseuche ist bisher nur unzureichend geklärt; die verfügbaren diagnostischen Tests eignen sich für die Herdendiagnose, sind aber für die Einzeltierdiagnose nur begrenzt aussagekräftig. Die gegenwärtig genutzten Impfstoffe schützen nicht zuverlässig vor einer Infektion und können schwere Impfreaktionen auslösen. Die Identifizierung von bisher unbekannten immunogenen Proteinen ist eine Voraussetzung für die Entwicklung neuer diagnostischer Testverfahren und Impfstoffen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde eine M13-basierte „phage display“ Methode basierend auf dem Helferphagen „Hyperphage“ verwendet. Um die MmmSC Expressionsgenbank zu konstruieren, wurde die genomische DNA mit fünf unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen verdaut, die glatte Ende verursachen. DNA-Fragmente von 200 bis 800 bp Länge wurden isoliert und in den Vektor pHORF3 und zwei Derivate, die im Rahmen dieser Arbeit konstruiert wurden, ligiert. Die Genbank wurde in „Hyperphage“ verpackt; positive Klone wurden in einem „panning“ mit einem Positivserum untersucht, dass aus gleichen Teilen der Seren von 10 positiven Tieren bestand. Nach vier „panning“-Runden wurden 147 einzelne Phagenklone sequenziert; dabei wurden 22 unterschiedliche MmmSC Proteine indentifiziert, von denen einige bereits als immunogen oder als virulenzassoziiert beschrieben wurden. Um die Klone zu identifizieren, die sich potentiell am besten als Antigen in einem diagnostischen ELISA eignen, wurde eine ELISA-basierte Selektion vorgenommen. Zunächst wurden die acht Klone ausgewählt, die den höchsten ELISA Titer mit dem positiven Kontrollserum erbrachten. Diese wurden dann durch Vergleich der Titer zwischen Positiv- und Negativserum auf ihre Diskriminierungsfähigkeit hin untersucht. Sechs der Klone zeigten einen mindestens vierfachen Titer-Unterschied zwischen positivem und negativem Kontrollserum. Diese Klone wurden auf ihre Reaktion mit 10 individuellen Positivseren hin untersucht. Vier Klone, die für Epitope der „acyl carrier protein phosphodiesterase” (MSC_029), einer “glycosyl transferase” (MSC_108), eines “conserved hypothetical protein” (MSC_636) and einer “AAA family ATPase” (MSC_1062) kodierten, reagierten hoch positiv mit allen Seren. Sie wurden anschließed auf Kreuzreaktivität mit Kaninchenseren untersucht, die gegen 17 andere Mykoplasmenspezies gerichtet sind. Ein Klon “AAA family ATPase” (MSC_1062) zeigte eine starke Kreuzreaktion mit dem Serum gegen M. canadense während die anderen drei Klone keine derart starke Kreuzreaktion zeigten. Um eine effiziente Produktion dieser drei Antigene zu erreichen, wurden die immunreaktiven Epitope als GST-Fusionsprotein exprimiert. Der Teil des jeweiligen Gens, der das immunogene Peptid kodiert und zwischen zwei TGA-Kodons lokalisiert ist, wurde mittels PCR amplifiziert; dabei wurden Primer verwendet, die eine singuläre Restriktionsenzymschnittstelle an ihrem jeweiligen 5’-Ende tragen, um so eine gerichtete Klonierung in den Expressionsvektor pGEX5x-2 zu ermöglichen. Die Fusionsproteine wurden als Einschlusskörperchen präpariert und es wurde gezeigt, dass sie spezifisch-immunreaktiv im Western Blot mit dem positiven Kontrollserum reagierten; sie zeigten ebenfalls eine spezifische und positive Reaktion in einem ELISA mit Kaninchenhyperimmunserum. In einem ELISA mit positivem und negativem bovinem Kontrollserum zeigte jedoch auch das negative Kontrollserum eine deutliche Reaktion und Zudem zeigte sich eine hohe „inter-assay“ Variation; Dadurch war keine aussagekräftige Diskriminierung zwischen positivem und negativem Serum möglich. Somit sind die in dieser Arbeit identifizierten immunogenen Antigene potentiell für die Entwicklung neuer diagnostischer Tests und/oder Impfstoffe geeignet, aber weitere Arbeiten sind erforderlich, um ihre praktische Applikation zu ermöglichen.

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Naseem, Shamoon: Identification and molecular characterization of immunogenic antigens in Mycoplasma mycoides subsp. mucoides small colony type. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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