Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die Rolle des Sphingosin-1-Phosphats in der Pathogenese allergisch-entzündlicher Hauterkrankungen

Reines, Ilka

In the present study the influence of sphingosine-1-phosphate (S1P)-receptor-agonists and -antagonists on dendritic cells, T-cells and keratinocytes in vitro and in vivo was investigated. During In-vivo-tests, it was of interest whether the test substances may inhibit the allergic reaction in the sensitization phase as well as in the challenge phase thereby decreasing the manifestation of contact dermatitis. As agonists FTY720 and its natural ligand S1P as well as the specific S1P1-agonist SEW2871 were used. W146 (S1P1) and VPC23019 (S1P1/S1P3) were used as antagonists. In vivo efficacy of S1P-receptor-agonists was analysed in a model of TDI-induced allergic contact dermatitis, during the sensitization and the elicitation phase. As functional parameters the inflammatory allergen-induced ear swelling (Mouse-Ear-Swelling-Test), the cellular reaction in the draining lymph nodes (weight, number of total cells, rate of CD 11c/CD 40 positive cells, cytokine production), the migration of dendritic cells out of ear skin as well as the determination of MHC-II+-cells in the epidermis were used. In the challenge phase additionally the composition of MHC-II+-, CD3+ and GR-1+-cells in the skin was studied. As migration of Langerhans cells (LC) from the skin to the lymph node displays an essential step in the pathogenesis of allergic contact dermatitis (ACD), the inhibition of LC-migration could be a novel strategy to improve this skin disease. Therefore, we focused on the investigation of topically administered S1P, FTY720 and SEW2871 on dendritic cell function in the murine model of ACD. In the sensitization phase, FTY720 and S1P reduced the weight and cell count of the draining auricular lymph node, as well as immigrated dendritic cells (CD 11c+/CD 40+-cells) provoked by repetitive topical administration of the hapten. In addition, the topical application of S1P and FTY720 impaired the cytokine production profile of IL-6 and IFN-g in the draining lymph node. In accordance to the reduced number of CD 11c+/CD 40+-cells, the density of LC in the epidermis was higher in FTY720 and S1P treated mice compared to vehicle treatment. A skin dendritic cell migration assay confirmed the significant inhibition of dendritic cell migration by FTY720 and S1P. Topical application of SEW2871 only slightly reduced the number of CD 11c+/CD 40+-cells in the auricular lymph node. These results indicate that not all effects are mediated solely via the S1P1, or more precisely its internalization. In-vitro-experiments with the S1P1 antagonist W146 and the S1P1/S1P3 antagonist VPC23019 indicate that blocking of S1P3 is essential for a complete inhibition DC migration. In the elicitation phase of ACD topical administration of FTY720 as well as S1P inhibited the inflammatory reaction and resulted in a vastly reduced accumulation of T-cells in the skin. Furthermore, a reduction of MHCII+-cells is apparent, indicating a reduced influx of antigen presenting cells into the site of antigen challenge. Keratinocytes release a variety of cytokines and chemokines and play a pivotal role in acute and chronic allergic inflammatory diseases, too. Thus, we investigated the impact of S1P-agonists on cytokine secretion from keratinocytes in vitro. The results indicate that S1P and FTY720 are able to reduce the IL-8 and KC secretion (murine IL-8 homologue) in stimulated canine and murine keratinocyte cell lines, respectively. These data supply conclusive evidence that the strategy of targeting the migratory response of LC with locally acting S1P or FTY720, as well as the modulation of the cytokine production profile, represents a novel option in the treatment of allergic skin diseases like contact hypersensitivity and atopic dermatitis.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Sphingosin-1-Phosphat (S1P)-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten auf dendritische Zellen (DC), T-Zellen und Keratinozyten in vitro und in vivo untersucht. Bei den In-vivo-Untersuchungen war es von besonderem Interesse, ob die eingesetzten Testsubstanzen die allergische Immunreaktion sowohl in der Sensibilisierungsphase als auch in der Challengephase hemmen können und somit die Manifestation der Kontaktallergie unterdrückt wird. Als Agonisten wurden FTY720 und sein natürlicher Ligand S1P sowie der spezifische S1P1-Agonist SEW2871 eingesetzt. Als Antagonisten wurden W146 (S1P1) und VPC23019 (S1P1/S1P3) verwendet. In vivo wurde der Einfluss der S1P-Rezeptor-Agonisten im murinen Kontaktallergiemodell in der Sensibilisierungs- und in der Challengephase untersucht. Als funktionelle Parameter dienten die entzündliche Ohrschwellung im Mouse-Ear-Swelling-Test, die zelluläre Reaktion im regionären Lymphknoten (Gewicht, Gesamtzellzahl, Anteil CD 11c/CD 40 positiver Zellen, Zytokinsekretion), die Migration dendritischer Zellen im Skin-DC-Migration-Assay, die Bestimmung der MHC-II+-Zellen in der Epidermis sowie in der Challenge zusätzlich die Bestimmung der MHC-II+-, CD3+- und GR-1+-Zellen in der Haut. Da die Migration von Langerhans-Zellen (LC) aus der Haut zu den Lymphknoten einen wesentlichen Schritt in der Pathogenese der allergischen Kontaktdermatitis (ACD) darstellt, könnte die Hemmung der LC-Migration eine neuartige Strategie zur Verbesserung solcher Hauterkrankungen darstellen. Im Maus-Modell der ACD wurde daher besonderes Augenmerk auf die Beeinflussung der DC-Migration durch topisch verabreichtes S1P, FTY720 und SEW2871 gelegt. In der Sensibilisierungsphase reduzierten FTY720 und S1P das Gewicht und die Zellzahl der regionären Lymphknoten (Lnn. auriculares) sowie die Anzahl der durch die wiederholte topische Verabreichung des Haptens eingewanderten dendritischen Zellen (CD 11c+/CD 40+). Des Weiteren modulierte die lokale Applikation von S1P und FTY720 das Zytokinmuster in den regionalen Lymphknoten. Die Lymphknotenzellen S1P- und FTY720-behandelter Tiere zeigten eine signifikant geringere Sekretion der Zytokine IL-6 und IFN-g. Entsprechend der verminderten Anzahl CD 11c+/CD 40+-Zellen war die Dichte der LC in der Epidermis FTY720- und S1P-behandelter Mäuse höher als bei den Vehikel-behandelten Tieren. Ein durchgeführter Skin-DC-Migration-Assay bestätigte die signifikante Hemmung der Migration dendritischer Zellen von FTY720 und S1P. Die topische Applikation von SEW2871 hatte nur einen geringen Einfluss auf die Anzahl von CD 11c+- und CD 40+-Zellen im Lymphknoten. Dies zeigt, dass nicht alle Effekte ausschließlich über den S1P1-Rezeptor beziehungsweise dessen Internalisierung vermittelt werden. Tatsächlich deuten In-vitro-Versuche mit dem S1P1-Antagonisten W146 und dem S1P1/S1P3-Antagonisten VPC23019 darauf hin, dass die Hemmung von S1P3 für eine vollständige Hemmung der DC Migration von Bedeutung ist. In der Auslösephase führten sowohl FTY720 als auch S1P zu einer verminderten entzündlichen Reaktion der ACD sowie zu einer reduzierten Akkumulation von T-Zellen in der Haut. Darüber hinaus wurde eine Verringerung der MHC-II+-Zellen ersichtlich, was auf einen reduzierten Zustrom von antigenpräsentierenden Zellen zum Ort der Antigen-Challenge hinweist. Da die Keratinozyten durch die Synthese von Zytokinen und Chemokinen ebenfalls eine zentrale Stellung bei akuten und chronischen entzündlichen Prozessen einnehmen, wurde in vitro die Wirkung der S1P-Rezeptor-Agonisten auf die Funktion caniner und muriner Keratinozyten getestet. Es wird deutlich, dass S1P und FTY720 einen inhibierenden Effekt auf die IL-8- und KC-Sekretion (murines IL-8 Homolog) stimulierter caniner und muriner Keratinozyten ausüben können. Diese Daten liefern schlüssige Beweise, dass die Beeinträchtigung der Migration von LC mit lokal verabreichtem S1P oder FTY720 wie auch die Modulation der Zytokinproduktion eine neuartige Option in der Behandlung allergischer Hauterkrankungen wie der allergischen Kontaktdermatitis und der atopischen Dermatitis darstellen können. Des Weiteren kann im Hinblick auf allergische Erkrankungen wie der atopischen Dermatitis vermutet werden, dass die topische Verabreichung von FTY720 und S1P gegenüber der systemischen Verabreichung einen Vorteil und geringere unerwünschte systemische Wirkungen haben könnte.

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Reines, Ilka: Die Rolle des Sphingosin-1-Phosphats in der Pathogenese allergisch-entzündlicher Hauterkrankungen. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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