Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Expression des Myosins A aus Toxoplasma gondii mit dem Baculovirus-Expressionssystem und Strukturmodellierung mittels MODELLER

Schaal, Lena Louise Ruth

Toxoplasma gondii is an obligatory intracellular protozooical parasite which has to invade host cells in order to replicate. For this invasion, gliding motility is required which is triggered via an acto-myosin-complex. Myosin A plays an important role in this complex. Together with its associated light chain (TgMLC1) and the two glidosom associated proteins (GAP45 and GAP50) it forms the glidosom. This is anchored to the parasites inner membrane complex via the GAP50 protein. Aktin is anchored to the host cell plasma membrane through a transmembrane receptor and aldolases. Only through the ancoring of these improtant proteins can the capping occur, where the host cell membrane encircles the parasite and the replication then takes place inclosed in a parasitophorous vacuole. Myosin A is therefore essential for the survival of the parasite and a good target for specific drugs. Until now it has not been possible to express Toxoplasma-gondii-Myosin-A (TgMyoA) in large quantities. It could only be expressed in small amounts and with great effort in the parasite itself. Kinetic studies of this protein revealed that TgMyoA moves with a motility of 5.2 µm/s and a step size of 5.3 nm towards the plus end of the actin filament. These kinetic characteristics are similar to those of fast muscle myosin II. In order to express large quantaties of TgMyoA for crystallisation trials and to search for specific inhibitors it was essential to find an expression system which produces large amounts of protein. It has been prooved that the baculovirus expression system expresses large quantaties of protein with little effort but no expression could be attained in the ovarian cells of the fall armyworm Spodoptera frugiperda. Only at the end of my work expression could be realized in the ovarian cells of the cabbage looper Trichoplusia ni. This successful expression provides an important basis for further studies. As the quantaties of the expression were not sufficient to crystallize the protein a model was built with homology modelling using the computer programme MODELLER. The model was obtained using the structures of the scallop myosin and the tail domain of the Plasmodium- falciparum- Myosin- A (PfMyoA) as templates. To demonstrate the interaction of the TgMyoA with its associated light chain, the TgMLC1 was modelled using the known structure of the Plasmodium-falciparum-Myosin-A-tail interacting protein (PfMTIP). As the PfMyoA-PfMTIP complex was already known a modell of the TgMyoA-TgMLC1 complex could be built by manually docking the two proteins. The interacting residues of the TgMyoA-TgMLC1 complex are very specific and therefore a very good aim for inhibitors. These models can now be used to test specific inhibitors with special docking programmes. Some inhibitors may show good fitting whereas others can be ruled out which can give good indication which inhibitors should be tested in vitro.

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer einzelliger Parasit, der zur Replikation in eine Wirtszelle eindringen muß. Dies geschieht über die gleitende Bewegung, welche von einem Aktin-Myosin-Komplex angetrieben wird. Das Myosin A (TgMyoA) spielt hierbei eine entscheidende Rolle. Es bildet zusammen mit einer assoziierten leichten Kette (TgMLC1) und zwei gliding associated-Proteinen (GAP45 und GAP50) das Glidosom. Das GAP50 sorgt für die starre Verankerung des Glidosoms am Inneren Membran-Komplex (IMC) des Parasiten. Aktin wird über Aldolasen und einen Transmembranrezeptor an der Wirtszellmembran verankert. Dies bildet die Grundlage des capping-Modells, bei der sich die Wirtszellmembran über den Parasiten stülpt. Die Replikation findet so in einer parasitophoren Vakuole statt. TgMyoA ist somit essentiell für das Überleben des Parasiten und ein guter Angriffspunkt für spezifische Therapeutika. Bislang war es jedoch nicht möglich das Myosin A aus Toxoplasma gondii in großen Mengen zu exprimieren. Es konnten nur geringe Mengen Protein unter großem Aufwand in Toxoplasma gondii selbst exprimiert werden. Bisherige kinetische Untersuchungen zeigten, dass sich TgMyoA zum Plus-Ende des Aktinfilamentes bewegt. Mit einer Motilität von 5,2 µm/s und einer Schrittweite von 5,3 nm hat es vergleichbare Eigenschaften wie schnelles Muskelmyosin II. Damit das Protein aufgereinigt, das Myosin kristallisiert und spezifische Inhibitoren gefunden werden können, war es essentiell, möglichst große Mengen Protein zu exprimieren. Dies sollte mit dem Baculovirus-Expressionssystem geschehen, da hiermit Proteine in großen Mengen unter geringem Aufwand exprimiert werden können. In den Ovarzellen des Nachtfalters Spodoptera frugiperda konnte keine Expression erzielt werden. Diese gelang erst am Ende meiner Arbeit in den Ovarzellen des Nachtfalters Trichoplusia ni. Die erfolgreiche Expression stellt eine wichtige Grundlage für die weitere Forschung dar. Da noch keine ausreichenden Mengen für eine Kristallisation des Proteins bereitstanden, wurde mit Hilfe des Computerprogramms MODELLER durch Homologiemodellierung zum Jakobsmuschelmyosin sowie der schon vorhanden Struktur der Schwanzdomäne des Myosins A aus Plasmodium falciparum ein Modell des TgMyoA erstellt. Um die Interaktion mit der leichten Kette zu demonstrieren wurde die leichte Kette mit Hilfe des bekannten Plasmodium falciparum Myosin A-tail interacting protein (PfMTIP) modelliert. In Anlehnung an dem bekannten Plasmodium falciparum Myosin A-PfMTIP-Komplex wurde ein Docking der beiden Strukturen durchgeführt, bei dem das TgMyoA mit der leichten Kette in Verbindung gebracht wurde. So konnten diejenigen Aminosäuren, welche wichtig für die Interaktion der leichten mit der schweren Kette des Myosins A sind, dargestellt werden. Diese interagierenden Aminosäuren sind sehr charakteristisch für den TgMyoA-TgMLC1-Komplex und stellen somit einen weiteren sehr spezifischen Angriffspunkt für Inhibitoren dar. Mit diesen Modellen können spezifische Inhibitoren in silico auf eine mögliche Bindung getestet werden und so unter der Vielzahl von Strukturen jene herausgefiltert werden, die eine gute Anpassung zeigen bzw. nicht passende ausgegrenzt werden. Dies gibt einem für in vitro Tests sehr wertvolle Anhaltspunkte und eine überschaubare Anzahl an Inhibitoren, die getestet werden müssen.

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Schaal, Lena Louise Ruth: Expression des Myosins A aus Toxoplasma gondii mit dem Baculovirus-Expressionssystem und Strukturmodellierung mittels MODELLER. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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