Comparison between detecting Salmonella spp. by bacteriological method and Real-Time PCR assay in samples from pig herds

Salmonellen stellen weltweit eine der Hauptursachen lebensmittelbedingter Erkrankungen dar und verursachen gleichzeitig wirtschaftliche Verluste in der Nahrungsmittelindustrie. Die Isolierung und Identifikation von Krankheitserregern in Lebensmitteln durch die traditionelle kulturelle Untersuchungsmethode wird als „Gold Standard“ bezeichnet und bis heute durchgeführt. Der kulturelle Nachweis von Salmonellen ist sehr zeit- und materialaufwendig und somit für Routineuntersuchungen bei hohem Probenaufkommen nicht immer optimal (MYINT et al. 2006). Die real-time PCR ist eine schnelle, sensitive und spezifische Methode zum Auffinden spezifischer DNA und eignet sich daher auch besonders zum Nachweis lebensmittelbedingter Krankheitserreger als Routinemethode (WOLFFS et al. 2006). Das Ziel dieser Studie ist die Untersuchung, ob die real-time PCR eine geeignete Methode zum Nachweis von Salmonellen in Schweinebeständen ist. Im Vergleich mit der kulturellen Methode soll die Sensitivität und Spezifität der real-time PCR überprüft werden. Das Ziel der Studie ist die Überprüfung der Verwendung der real-time PCR als Untersuchungsmethode zur Diagnostik von Salmonellen bzw. für den Einsatz beim Salmonellenmonitoring in Schweinebeständen zum Auffinden der Eintragsquellen. Die Untersuchung wurde in 48 Schweinebetrieben im Nordwesten Deutschlands durchgeführt, die aufgrund des positiven Salmonellenantikörpernachweises nach dem QS-System in Kategorie III ( hohe Salmonellenantikörperbelastung) eingestuft wurden. Insgesamt wurden 906 Proben unterschiedlicher Herkunft (Sammelkotproben, Abstriche von Stallwänden, vom Stallgangboden, den Futterautomaten, Stiefeln usw.) gleichzeitig mittels kultureller Methode und real-time PCR in der Außenstelle für Epidemiologie in Bakum untersucht. Alle Proben wurden in gepuffertem Peptonwasser (Voranreicherung) bei 37°C für 18±2 Stunden angereichert. Anschließend wurden die Proben gleichzeitig nach dem standardisierten real-time PCR Anweisungsprotokoll sowie mit der konventionellen bakteriologischen Methode getestet. Die real-time PCR wurde anhand der Herstellerangaben des TaqMan® Salmonella enterica Detection Kit durchgeführt. Der Untersuchungsprozess wurde mit dem ABI Prism 7500 real-time PCR System vollzogen. Die Ergebnisse wurden anhand des SDS version 1,4 (Applied Biosystems; USA) analysiert. Die bakteriologische Überprüfung auf Salmonellen aus der Voranreicherung wurde gemäß der DIN-ISO 6579 durchgeführt. Die Typisierungen der isolierten Salmonellenstämme erfolgten in Zusammenarbeit mit dem Robert-Koch-Institut in Wernigerode. Abschließend wurden die Ergebnisse durch das SAS 9,1 (Statistical Analysis System; USA.) analysiert, um den Konkordanz-Index Kappa, die relative Sensitivität und Spezifität der real-time PCR und seine Gültigkeit für die Untersuchung von Schweinebeständen zu ermitteln. Mit der real-time PCR wurden 337 von 906 (37,19%) und mit dem konventionellen Verfahren 187 von 906 (20,64%) als positive Proben ermittelt. Alle 185 positiven Proben aus dem konventionellen Verfahren wurden auch durch die real-time PCR nachgewiesen. Nach dem Konkordanz-Index Kappa ergibt sich eine deutliche Korrelation von 0,59 zwischen den beiden Methoden. Der durchschnittliche Ct-Wert (Threshold Cycle) für alle positiv getesteten Proben durch die real-time PCR lag bei 36,33. Wurden Salmonellen in den kulturellen Untersuchungen der Proben nach 24 Stunden (n=134) gefunden, betrug der durchschnittliche Ct-Wert 31,77. Für Proben, die nach 24 Stunden negativ, aber nach 48 Stunden positiv, sowie bei der real-time PCR positiv ausfielen (n=51), ergibt sich ein höherer Ct-Wert von 37,46. Proben, die in der kulturellen Untersuchungen auch nach 48 Stunden ein negatives Ergebnis bezüglich der Salmonellenkulturen zeigten, aber durch die real-time PCR (n=152) als positiv erkannt wurden, wiesen den durchschnittlich höchsten Ct-Wert von 39,56 auf, was eine niedrige bakterielle Konzentration in den flüssigen Medien aufzeigt. Verglichen mit den traditionellen kulturellen Untersuchungsmethoden führten die real-time PCR-Ergebnisse zu einer relativen Sensitivität von 98,93% und einer Spezifität von 78,86%, was eine hoch signifikante (r=0,6643; p<0,0001) Korrelation zwischen den beiden Untersuchungsverfahren ergibt. Die neuen Erkenntnisse zum Extrahieren der erforderlichen Salmonellen-DNA für die Erforschung von Salmonellen in Schweineproduktionsketten durch die real-time PCR wurden demonstriert. Die Verringerung des Zeit- und Arbeitsaufwands macht die sensitive und spezifische real-time PCR zu einer hervorragenden Alternative zu dem traditionellen kulturellen Verfahren. Die real-time PCR ist eine sehr effiziente Methode für die Durchführung von Salmonellenmonitoring und Salmonellenkontrolle in Schweinebeständen. Ferner ermöglicht es eine schnellere Entscheidung bezüglich der Reinigung und Desinfektion der Umgebung und Materialien, eine Trennung von mit salmonelleninfizierten Tieren innerhalb eines Bestandes und während des Tiertransportes sowie die gezielte Lenkung der Tierbewegungen zwischen salmonellenkontrollierten Schweinebeständen.