Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Comparison between detecting Salmonella spp. by bacteriological method and Real-Time PCR assay in samples from pig herds

Somyanontanagul, Noppadol

Salmonella spp. is the leading cause of worldwide food borne diseases and the resulting in economic loss for the food industries. Until now, conventional culture methods have traditionally been considered the “gold standards” for the isolation and identification of food borne pathogens. However, conventional culture techniques for the detection of Salmonella spp. need labour intensive and time consuming. Therefore, they are not suitable for routine testing of a large number of samples (MYINT et al. 2006). For this reason, the real-time PCR has become a powerful tool for the food borne pathogens detection. The real-time PCR is a rapid, sensitive and specific method for detecting specific DNA, and it has become routine method for identifying several bacterial and viral agents for many purposes (WOLFFS et al. 2006). The purpose of this study was to investigate the suitability of the real-time PCR assay for the detection of Salmonella spp. in samples from pig herds compared to conventional culture results to determine relative sensitivity and specificity of the real-time PCR. The overall goal was to study the possibility to use the real-time PCR as a routine laboratory method for control and monitoring program of Salmonella in pig herds. In total, 906 samples such as faeces, swabs from pen walls, floors, feeders, boots etc. from 48 Salmonella seropositive finishing pig herds (QS system; Category III) in the Northwest of Germany were simultaneously tested by real-time PCR assay and conventional bacteriological culture method that were established at the Filed station for epidemiology in Bakum. All samples were enriched in buffer peptone water at 37°C for 18±2 hours. Subsequently, each enrichment broth was tested simultaneously by the standardized real-time PCR protocol and by the conventional bacteriological culture method. The real-time PCR was carried out with the TaqMan®Salmonella enterica Detection Kit according to the manufacture instructions. Reactions were performed on the ABI Prism 7500 real-time PCR System; the results were analyzed with SDS version 1.4 (all Applied Biosystems; USA). The bacteriological detection of Salmonella from the enrichment broth was performed according to DIN-ISO 6579. All Salmonella isolates were sub-typed by phage-typing in cooperation with the Robert-Koch Institute in Wernigerode. In the end, the results were analyzed by SAS 9.1 (Statistical Analysis System, USA.) to determine the Correlation coefficient, Cohen’s Kappa-index, relative sensitivity and specificity of the real-time PCR applied to samples from pig herds. Overall, 337 of 906 (37.19%) samples were positive by real-time PCR and 187 of 906 (20.64%) were positive by conventional culture. The 185 samples positive by conventional culture were all positive by real-time PCR (modified setting). Therefore, Kappa-index was calculated as being 0.59, which means that correlation between the two methods is moderate. The average Ct (Threshold cycle) value for all samples positive by real-time PCR was 36.33. If Salmonella was detected by cultural examination after 24 hours (n=134), the average Ct value was 31.77. Samples, which were negative after 24 hours of culturing but positive after 48 hours and PCR positive (n=51), showed an increased Ct-value of 37.46. Those samples were also negative by cultural examination after 48 hours but positive by real-time PCR (n=152), demonstrated the highest average Ct-value of 39.56 which is correspondent to a very low bacterial load in the enrichment broth. The real-time PCR resulted in a relative sensitivity of 98.93% and specificity of 78.86%, compared with conventional culture, which the correlation coefficients (Pearson´s) between 2 type of methods was found high significant (r=0.6643, p<0.0001). The advance knowledge about how to extract the necessary Salmonella DNA amount for the detection of Salmonella spp. by means of the real-time PCR method and the development of a system for detecting Salmonella spp. within pig production chains was demonstrated. The reduction in time and labour make this highly sensitive and specific real-time PCR assay an excellent alternative to conventional culture methods. The real-time PCR would be highly valuable for Salmonella monitoring and control programmes also in pig herds. It offers decisions in due time such as after cleaning and disinfection. Moreover, it uses for decisions for pig movement between Salmonella controlled herds.

Salmonellen stellen weltweit eine der Hauptursachen lebensmittelbedingter Erkrankungen dar und verursachen gleichzeitig wirtschaftliche Verluste in der Nahrungsmittelindustrie. Die Isolierung und Identifikation von Krankheitserregern in Lebensmitteln durch die traditionelle kulturelle Untersuchungsmethode wird als „Gold Standard“ bezeichnet und bis heute durchgeführt. Der kulturelle Nachweis von Salmonellen ist sehr zeit- und materialaufwendig und somit für Routineuntersuchungen bei hohem Probenaufkommen nicht immer optimal (MYINT et al. 2006). Die real-time PCR ist eine schnelle, sensitive und spezifische Methode zum Auffinden spezifischer DNA und eignet sich daher auch besonders zum Nachweis lebensmittelbedingter Krankheitserreger als Routinemethode (WOLFFS et al. 2006). Das Ziel dieser Studie ist die Untersuchung, ob die real-time PCR eine geeignete Methode zum Nachweis von Salmonellen in Schweinebeständen ist. Im Vergleich mit der kulturellen Methode soll die Sensitivität und Spezifität der real-time PCR überprüft werden. Das Ziel der Studie ist die Überprüfung der Verwendung der real-time PCR als Untersuchungsmethode zur Diagnostik von Salmonellen bzw. für den Einsatz beim Salmonellenmonitoring in Schweinebeständen zum Auffinden der Eintragsquellen. Die Untersuchung wurde in 48 Schweinebetrieben im Nordwesten Deutschlands durchgeführt, die aufgrund des positiven Salmonellenantikörpernachweises nach dem QS-System in Kategorie III ( hohe Salmonellenantikörperbelastung) eingestuft wurden. Insgesamt wurden 906 Proben unterschiedlicher Herkunft (Sammelkotproben, Abstriche von Stallwänden, vom Stallgangboden, den Futterautomaten, Stiefeln usw.) gleichzeitig mittels kultureller Methode und real-time PCR in der Außenstelle für Epidemiologie in Bakum untersucht. Alle Proben wurden in gepuffertem Peptonwasser (Voranreicherung) bei 37°C für 18±2 Stunden angereichert. Anschließend wurden die Proben gleichzeitig nach dem standardisierten real-time PCR Anweisungsprotokoll sowie mit der konventionellen bakteriologischen Methode getestet. Die real-time PCR wurde anhand der Herstellerangaben des TaqMan® Salmonella enterica Detection Kit durchgeführt. Der Untersuchungsprozess wurde mit dem ABI Prism 7500 real-time PCR System vollzogen. Die Ergebnisse wurden anhand des SDS version 1,4 (Applied Biosystems; USA) analysiert. Die bakteriologische Überprüfung auf Salmonellen aus der Voranreicherung wurde gemäß der DIN-ISO 6579 durchgeführt. Die Typisierungen der isolierten Salmonellenstämme erfolgten in Zusammenarbeit mit dem Robert-Koch-Institut in Wernigerode. Abschließend wurden die Ergebnisse durch das SAS 9,1 (Statistical Analysis System; USA.) analysiert, um den Konkordanz-Index Kappa, die relative Sensitivität und Spezifität der real-time PCR und seine Gültigkeit für die Untersuchung von Schweinebeständen zu ermitteln. Mit der real-time PCR wurden 337 von 906 (37,19%) und mit dem konventionellen Verfahren 187 von 906 (20,64%) als positive Proben ermittelt. Alle 185 positiven Proben aus dem konventionellen Verfahren wurden auch durch die real-time PCR nachgewiesen. Nach dem Konkordanz-Index Kappa ergibt sich eine deutliche Korrelation von 0,59 zwischen den beiden Methoden. Der durchschnittliche Ct-Wert (Threshold Cycle) für alle positiv getesteten Proben durch die real-time PCR lag bei 36,33. Wurden Salmonellen in den kulturellen Untersuchungen der Proben nach 24 Stunden (n=134) gefunden, betrug der durchschnittliche Ct-Wert 31,77. Für Proben, die nach 24 Stunden negativ, aber nach 48 Stunden positiv, sowie bei der real-time PCR positiv ausfielen (n=51), ergibt sich ein höherer Ct-Wert von 37,46. Proben, die in der kulturellen Untersuchungen auch nach 48 Stunden ein negatives Ergebnis bezüglich der Salmonellenkulturen zeigten, aber durch die real-time PCR (n=152) als positiv erkannt wurden, wiesen den durchschnittlich höchsten Ct-Wert von 39,56 auf, was eine niedrige bakterielle Konzentration in den flüssigen Medien aufzeigt. Verglichen mit den traditionellen kulturellen Untersuchungsmethoden führten die real-time PCR-Ergebnisse zu einer relativen Sensitivität von 98,93% und einer Spezifität von 78,86%, was eine hoch signifikante (r=0,6643; p<0,0001) Korrelation zwischen den beiden Untersuchungsverfahren ergibt. Die neuen Erkenntnisse zum Extrahieren der erforderlichen Salmonellen-DNA für die Erforschung von Salmonellen in Schweineproduktionsketten durch die real-time PCR wurden demonstriert. Die Verringerung des Zeit- und Arbeitsaufwands macht die sensitive und spezifische real-time PCR zu einer hervorragenden Alternative zu dem traditionellen kulturellen Verfahren. Die real-time PCR ist eine sehr effiziente Methode für die Durchführung von Salmonellenmonitoring und Salmonellenkontrolle in Schweinebeständen. Ferner ermöglicht es eine schnellere Entscheidung bezüglich der Reinigung und Desinfektion der Umgebung und Materialien, eine Trennung von mit salmonelleninfizierten Tieren innerhalb eines Bestandes und während des Tiertransportes sowie die gezielte Lenkung der Tierbewegungen zwischen salmonellenkontrollierten Schweinebeständen.

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Somyanontanagul, Noppadol: Comparison between detecting Salmonella spp. by bacteriological method and Real-Time PCR assay in samples from pig herds. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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