Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Cellular and molecular characteristics of preimplantation in vitro produced embryos from pre- and post-pubertal heifers and their relationship with apoptosis

Zaraza González, Javier de Jesús

Bovine pre-pubertal oocytes and in vitro produced embryos differ from their adult counterparts with regard to their morphological, molecular characteristics and developmental capacity. Intraovarian injection of IGF-I was used with the aim to improve the in vitro embryo developmental competence and to determined on the expression of apoptosis-related genes in oocytes and in vitro-produced embryos of pre-pubertal (preP [7 to 10 months]) and post-pubertal (postP [11 to 18 months]) superovulated dairy heifers subjected to OPU. The IGF-I groups (IGF-I-preP n=15, IGF-I-postP n=10) received 6 µg IGF-I, diluted in 600 µl of PBS/BSA, in ovarian stroma. Control groups (C-preP n=16, C-postP n=10) were injected with 600 µl PBS/BSA. Comparisons were also made with non-superovulated dry cows (n=17). OPU retrieved immature oocytes, in vitro matured, in vitro fertilized, in vitro produced 2-4, 8-16 cell embryos and blastocysts at 8days of development were subjected to Reverse Transcription (RT) -Real Time PCR to determine the relative mRNA abundance of the genes coding for AKT1, BAD, BAX, BCL-XL, GLUT3 and GLUT8. The TUNEL assay was applied to determine the degree of apoptosis in 8 day old in vitro produced blastocysts. Significant differences were found for the blastocyst rates in IGF-I, preP: 11.2 ± 17 %; control, preP: 10.4 ± 20.3%; IGF-I, postP: 10.9 ± 17.1% in comparison to control postP: 21.2 ± 27.2 % and cows 23 ± 27.1% (P£0.001). The intraovarian application of IGF-I affected negatively the transcription of AKT1 in pre-pubertal calves immature oocytes that can be demonstrated with the fact that immature oocytes derived from cows had a higher mRNA relative abundance of AKT1 than oocytes from IGF-I, preP.  At 2-4 cell and 8-16 cell embryo stage, the amounts of BAD transcripts were higher in embryos derived from control postP heifers compared with other groups (p£0.05). Inherited maternal mRNA amounts of BCL-XL were significantly higher in immature oocytes in all groups compared to in vitro matured oocytes and in 2-4 cell embryos (p£0.05). Lowest transcripts levels were detected at the 8-16 cell stage (p£0.05). BCL-XL and BAX transcripts were higher in post-pubertal (postP) heifers derived blastocysts than in those derived from cows. GLUT3 starts to be transcribed at the 8-16 cell embryo stage concomitant with maternal/embryonic transition in the bovine embryos. The mRNA relative abundance of GLUT8 was higher in immature oocytes derived from cows compared to those derived from IGF-I treated calves (p£0.05). GLUT8 transcripts were significantly higher in immature oocytes in comparison with in vitro matured oocytes, 2-4 cell and 8-16 cell embryos. Blastocysts derived from cows showed the lowest number of apoptotic nuclei and apoptotic index compared to blastocysts from pre- and post-pubertal donors (p£0.05). The presence of apoptosis in late preimplantation developmental stages can be affected by the age of the donor and can be used as a quality feature for the lower developmental capacity of embryos derived from pre-pubertal donors. In conclusion, IGF-I applied in higher doses (6µg) in the ovarian stroma reduce the developmental capacity of in vitro produced embryos and increase the presence of apoptosis in embryonic cells. Results of this study show that the age of the donor affected mRNA expression of genes linked with apoptosis (AKT, BAX, BCL-XL) and embryo metabolism (GLUT8) and the lower or higher expression of these genes can be predictive for the future developmental capacity of the embryo.

Präpuberale Oozyten und in vitro produzierte Embryonen unterscheiden sich von denen erwachsener Spendertiere in ihren morphologischen und molekularen Eigenschaften sowie in ihrer Entwicklungskapazität. Es wurde IGF-I intraovariell appliziert (6 μg), mit dem Ziel, die in vitro Entwicklungsfähigkeit von Embryonen zu verbessern und die Expression der mit Apoptose verbundener Gene in Oozyten und in vitro produzierten Embryonen aus prä- und postpuberalen Rindern zu bestimmen. Dazu wurde an 31 präpuberalen Kälbern im Alter von 7-10 Monaten der Rassen Holstein Friesian und Deutsches Schwarzbuntes Rind Ultraschall geleitete Follikelpunktionen (Ovum Pick-up) durchgeführt (rhIGF-I; n=15  und Kontrolle; n=16) so wie an 20 postpuberalen Rinder im Alter von 11-18 Monaten (IGF-I; n=10  und  Kontrolle; n=10 ). 17 trockenstehende Kühe dienten als Kontrollgruppe. Die gewonnenen Oozyten wurden in vitro gereift, in vitro fertilisiert und es wurden 2-4 und 8-16 Zellembryonen und Blastozysten (8. Entwicklungstag) produziert und wurden anschließend einer Reverse Transkription (RT) Real Time PCR unterzogen, um den relativen Transkriptgehalt der Gene AKT1, BAD, BAX, BLC-XL, GLUT3 und GLUT8 zu bestimmen. Zur Bestimmung des Apoptosegrades in Blastozysten wurde die TUNEL Methode angewendet. Signifikante Unterschiede wurden bei Blastozystenraten in Kälber IGF-I: 11,2 ± 17%; Kälber Kontrolle: 10,4 ± 20,3%; Rinder IGF-I: 10,9 ± 17%,1 im Vergleich zur Rinder Kontrollgruppe: 21,2 ± 27,2% und Kühen: 23,0 ± 27,1% festgestellt (p≤0,001). Durch die IGF-I Applikation wird die Transkription des AKT1 Gens bei präpuberalen Kälbern beeinflusst. Unreife Oozyten von Kühen wiesen einen höheren Transkriptgehalt von AKT1 mRNA auf als Oozyten von 7-10 Monate alten Kälbern mit intraovarieller Applikation von IGF-I. Im Vergleich zu den anderen Entwicklungsstadien wiesen ungereifte Oozyten eine höhere, maternal vererbte BAD mRNA Menge auf. Die Expression von BAX in unreifen, in vitro gereiften Oozyten, 2-4 und 8-16 Zellstadien war zwischen den Versuchsgruppen ähnlich. Die maternale Menge von BCL-XL mRNA war in unreifen Oozyten aller Gruppen signifikant höher als in in vitro gereiften Oozyten und 2-4 Zellembryonen (p≤0,05).  In Blastozysten von 11-18 Monate alten Rindern (IGF-I und Kontrolle) war BAX und BCL-XL höher exprimiert als in Blastozysten von Kühen (p≤0,05).  Die Transkription von GLUT3 beginnt in Rinderembryonen im 8-16 Zellstadium, d.h. parallel mit der Aktivierung des embryonalen Genoms. Die Menge von GLUT8 Transkripten war in unreifen Oozyten von Kühen signifikant höher als  IGF-I Kälber und höher in in vitro gereiften Oozyten, 2-4 Zellstadien und 8-16 Zellstadien. Blastozysten von Kühen wiesen im Vergleich zu Blastozysten von prä- und postpuberalen Spendertieren die niedrigste Anzahl an apoptotischen Zellkernen und Apoptose Index auf (p≤0,05). Eine höhere Dosierung von IGF-I kann die Entwicklungsfähigkeit in vitro produzierter Embryonen allerdings reduzieren und eine Vermehrung aus Apoptose. Das Vorkommen von Apoptose in späten präimplantatorischen Entwicklungsstadien kann durch das Alter der Spendertiere beeinflusst werden und als Indikator für niedrige Entwicklungskapazität von Embryonen präpuberaler Kälber genutzt werden. Abschließend kann man feststellen, dass das Alter der Spendertiere die Genexpression der mit Apoptose verbundenen Gene AKT, BAX, BCL-XL und das Stoffwechselgen GLUT8 beeinflusst.

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Zaraza González, Javier de Jesús: Cellular and molecular characteristics of preimplantation in vitro produced embryos from pre- and post-pubertal heifers and their relationship with apoptosis. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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