Interaktion des respiratorischen Synzytialvirus mit primärem Lungenepithelzellen

Goris, Katherina

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Interaktion des respiratorischen Synzytialvirus mit primärem Lungenepithelzellen

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Das Oberflächenglykoprotein F des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) spielt eine wichtige Rolle in der Anfangsphase der Infektion. Es ist nicht nur für die Fusion der Virusmembran mit der Zellmembran und die daraus resultierende Synzytienbildung verantwortlich, sondern verfügt auch über Bindungseigenschaften. Bekannt ist die Interaktion des F-Proteins mit heparin-ähnlichen Strukturen. Zudem gibt es Hinweise auf die Bindung an einen definierten Proteinrezeptor. Versuche mit Deletionsmutanten haben gezeigt, dass das F‑Protein ausreichend ist, um eine Infektion einzuleiten. Ein Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion von RSV mit respiratorischen Epithelzellen zu untersuchen. Um die primären Zielzellen des bovinen RSV (BRSV), die bovinen respiratorischen Epithelzellen (BAEC), zu untersuchen, wurden zwei Kultursysteme für enddifferenzierte BAEC etabliert: das „Air-liquid interface (ALI)-System“, in dem die respiratorischen Epithelzellen bis hin zur Zilienbildung enddifferenzieren, und Lungenpräzisionsschnitte (PCLS; presicion-cut lung slices) bei denen die respiratorischen Epithelzellen im ursprünglichen Gewebeverband verbleiben. Infektionsstudien mit diesen Kultursystemen primärer enddifferenzierter BAEC konnte gezeigt werden, dass BRSV nicht in der Lage war, eine Infektion in enddifferenzierten BAEC zu etablieren, während das bovine Parainfluenzavirus Typ 3 bei gleicher Multiplizität der Infektion (MOI) die Zellen sehr effizient infizierte. Zilientragende BAEC waren im ALI-System nur dann sensitiv gegenüber einer BRSV-Infektion, wenn dieses mit einer relativ hohen MOI appliziert worden war. In PCLS war das respiratorische Epithel auch bei Einsatz eines hoch-titrigen Virus resistent gegenüber einer Infektion durch BRSV. Diese Ergebnisse lassen mutmaßen, dass die durch BRSV vermittelte Erkrankung des Respirationstrakts von Kälbern den Einfluss verschiedener Umweltfaktoren voraussetzt, um das respiratorische Epithel für das Virus empfänglich zu machen. Das zweite Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung des zellulären Bindungspartners des HRSV F-Proteins. Zu diesem Zweck wurde ein rekombinantes Sendaivirus verwendet, SeV‑hF, das auf der Oberfläche anstelle der Sendaiproteine HN und F das HRSV-F-Protein trägt. Mit diesem Virus wurden Bindungstests mit auf Nitrozellulose immobilisierten zellulären Membranproteinen durchgeführt. Die Proteinsequenz eines mutmaßlichen Interaktionspartners von HRSV wurde mittels time-of-flight tandem mass spectrometry (ESI Q-TOF MS/MS) bestimmt. Es handelt sich hierbei um das Hitzeschockprotein gp96 (Glykoprotein 96 kDa), das hauptsächlich im ER lokalisiert ist, aber auch auf der der Zelloberfläche einer Vielzahl von Zellen vorkommt. Die funktionelle Charakterisierung von gp96 als potentieller Rezeptor für HRSV ist der Gegenstand künftiger Studien.

The surface glycoprotein F of respiratory syncytial virus (RSV) plays an important role during the initiation of infection. In addition to causing the fusion of the viral envelope with the cellular membrane, which results in syncytia formation, it also has binding properties. Known is the interaction of the F protein with heparin-like glycosaminoglycans. Furthermore, the available evidence suggests the binding to a defined protein. Results obtained with deletion mutants indicate that the F protein is sufficient to initiate the infection cycle. Aim of this PhD thesis was to investigate the interaction of RSV with respiratory epithelial cells. The primary target cells of bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine respiratory epithelial cells (BAEC) have been studied using two culture systems for well-differentiated BAEC: the air-liquid interface (ALI) system, where filter-grown BAEC differentiate into the different cell types of a respiratory epithelium, and presicion-cut lung slices (PCLS) where BAEC are maintained in the original tissue organisation. On the basis of infection studies with these two culture systems of well-differentiated BAEC it has been shown that at the same multiplicity of infection (MOI) BRSV was not able to establish an infection in well-differentiated BAEC whereas bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3) efficiently infected these cells. Ciliated BAEC in ALI culture became sensitive to BRSV, when the virus was applied at relatively high MOI. In PCLS, the ciliated epithelium was refractory to infection by BRSV even when high-titered virus way applied. Our findings raise the possibility that the respiratory tract disease in calves caused by BRSV may require environmental stimuli that render BAEC susceptible to infection. The second aim of this thesis was the identification and characterisation of a cellular binding partner of the HRSV F protein. For this purpose, binding tests with the recombinant Sendai virus SeV-hF have been performed. This virus carries the HRSV F protein on the surface instead of the SeV surface proteins HN and F and was used to detect the binding to cellular membrane proteins immobilised on nitrocellulose The protein sequence of a putative interaction partner of HRSV-F was determined by time-of-flight tandem mass spectrometry (ESI Q-TOF MS/MS). The protein sequenced was identified as the heat shock protein gp96 (glycoprotein of 96 kDa). Gp96 is mainly localised in the ER but also expressed on the surface of different cells. A potential role of gp96 as a receptor for HRSV has to be analyzed in future studies.