Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Isolation and characterisation of high-affinity peptides directed against surface glycoproteins of pathogenic viruses

Hüttinger, Carolin

For most viral diseases only symptomatic treatment is available. Highly pathogenic agents demand a search for compounds that can either be administered therapeutically or be employed in diagnostic assays in order to detect and confirm virus infection. Usually specific antibodies are used to provide evidence of viral antigen in ELISAs or immunofluorescence assays. This study evaluated the convenience of synthetic peptides as viral antigen detectors. To identify specific peptides for the targets of choice, the phage display technique was chosen due to the high variability of the phage library. In the first part of this work, general assay conditions were established by biopanning on the fusion protein of human respiratory syncytial virus presented on the surface of a recombinant Sendai virus. The peptides of the two isolated phages comprised the same twelve amino acids encoded by two different nucleotide sequences. The phage-displayed peptides recognised specifically the HRSV F protein in ELISA, immunofluorescence analysis, phage-overlay assay, co-immunoprecipitation and surface plasmon resonance analysis. The bovine respiratory syncytial virus is a close relative of HRSV. In ELISA, the binding of the phages to both viruses was equally strong. The phage-overlay assay and the co-immunoprecipitation experiments demonstrated a significantly weaker binding of the phages to bF than to hF. This might indicate that the structural domain that is recognised by the phages includes amino acids located in the F2 subunit which is different in both proteins. Based on the identified twelve amino acids, peptides were synthesised. These peptides recognised the HRSV F protein when they were coated in ELISA, but not when they were in solution while being incubated with the target. SPR analysis revealed that the immobilised peptides captured specifically the HRSV F protein; this suggests that a certain arrangement of several peptides is required for proper binding to the F protein. In the second part of this work, the spike protein of severe acute respiratory syndrome associated corona virus was selected to evaluate different ways of target presentation during the biopanning step. Neither S protein expression on BHK cells nor on the surface of VSV∆G yielded phages which displayed S protein specific peptides. In a third approach biopanning on concentrated cell culture supernatant containing soluble S protein was successful in isolating nine phages that recognised the target of interest. Although a consensus sequence failed to emerge, four phages bound to SARS-CoV in Sandwich-ELISA, immunofluorescence analysis and phage overlay assay. These clones might be considered specific for the S protein, although having a low affinity for their target; the five clones that lacked a positive binding signal in all assays other than the Sandwich-ELISA are most likely unspecific binders.

Für die meisten viral bedingten Erkrankungen existiert nur eine symptomatische Behandlung. Hoch pathogene Erreger erfordern eine Suche nach Stoffen, die entweder in der Therapie eingesetzt oder in diagnostischen Tests zum Virusnachweis verwendet werden können. Gewöhnlich wird in einem ELISA oder einem Immunfluoreszenztest virales Antigen mit Hilfe von spezifischen Antikörpern nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Zweckmäßigkeit von synthetischen Peptiden als Antigen-Detektoren untersucht. Aufgrund der hohen Variabilität einer Phagen Bank wurde die Phage-Display Technik verwendet, um spezifische Peptide für die gewählten Zielmoleküle zu isolieren. Im ersten Teil der Arbeit wurden allgemeine Bedingungen für die Durchführung der Experimente etabliert. Als Zielmolekül im Biopanning wurde das Fusionsprotein des humanen respiratorischen Syncytialvirus verwendet; das F-Protein wurde auf der Oberfläche von einem rekombinanten Sendai Virus präsentiert. Die zwei isolierten Phagen trugen Peptide, die aus den gleichen zwölf Aminosäuren bestanden und von zwei verschiedenen Nukleotidsequenzen kodiert wurden. Im ELISA, dem Immunfluoreszenztest, dem Phage-Overlay Test, der Co-Immunpräzipitation und der Surface Plasmon Resonance Analyse wurde die spezifische Bindung der Phagen an das F-Protein bestätigt. Das bovine respiratorische Syncytialvirus ist ein enger Verwandter des HRSV. Die Phagen banden im ELISA zu gleichen Maßen an beide Viren. Der Phage-Overlay Test und die Co-Immunpräzipitation zeigten eine signifikant schwächere  Bindung der Phagen an das bF-Protein als an das hF-Protein. Das könnte ein Hinweis sein, dass die von den Phagen erkannte strukturelle Domäne Aminosäuren der F2-Untereinheit enthält, die bei beiden Proteinen unterschiedlich ist. Anhand der zwölf identifizierten Aminosäuren wurden Peptide synthetisiert. Diese waren nur in der Lage das F-Protein zu binden, wenn sie im ELISA immobilisiert waren; waren die Peptide während der Inkubation in Lösung erkannten sie ihr Zielmolekül nicht. Die SPR Analyse zeigte eine spezifische Bindung der fixierten Peptide an das F-Protein, was darauf hindeutet, dass eine gewisse Anordnung mehrerer Peptide für das Erkennen nötig ist. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte verschiedene Arten der Präsentation des Zielmoleküls während des Biopannings; als Zielmolekül wurde das Spike-Protein des mit dem schweren akuten respiratorischen Syndroms assoziierten Coronavirus ausgewählt.  Weder die Expression auf der Oberfläche von BHK Zellen noch die in der Hülle von VSV∆G Pseudotypen lieferte Phagen, die spezifisch an das S-Protein banden. In einem dritten Ansatz wurde für das Biopanning ankonzentrierter Zellkulturüberstand von BHK Zellen verwendet, die mit einem Plasmid für ein lösliches S-Protein transfiziert worden waren. Auf diese Weise wurden neun Phagen isoliert, die das Zielmolekül erkannten. Obwohl die neun Peptide untereinander keine Ähnlichkeiten aufwiesen, banden vier Phagen sowohl im Sandwich-ELISA, als auch im Immunfluoreszenztest und dem Phage-Overlay Test an das S-Protein. Diese vier Phagen könnten als spezifisch für das S-Protein gelten, wenn auch ihre Affinität für das Zielmolekül als gering einzuschätzen ist. Die übrigen fünf Phagen, die in keinem anderen Test als dem Sandwich-ELISA eine Bindung aufwiesen, binden höchst wahrscheinlich unspezifisch an das S-Protein.

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Hüttinger, Carolin: Isolation and characterisation of high-affinity peptides directed against surface glycoproteins of pathogenic viruses. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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