Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Production of hA20-transgenic pigs by somatic cell nuclear transfer for xenotransplantation research

Oropeza, Marianne

The goal of this project was to produce hA20-transgenic pigs by somatic nuclear transfer (SCNT) with protective features for xenotransplantation. The first experimental phase included design and construction of two hA20 expression constructs (pCAGGSEhA20-IRESNEO and pEF1/HisAhA20). In the second phase porcine fetal fibroblasts (pffs) were isolated and transfected with the expression vectors. This was followed by SCNT cloning with hA20-transgenic pffs as donor cells. In the final phase of the project transgenic fetuses and piglets were analysed for hA20 expression and functionality of the transgene. The following results were obtained: 1) The production of two hA20 expression vectors was successful, and large amounts of each vector were produced for transfection experiments. 2) Transfection of pffs with pCAGGSEhA20-IRESNEO resulted in 82 resistant cell colonies. Five cell colonies were selected for SCNT experiments. A total of 12 sows served as recipient animals and 9 pregnancies were established (75%). The transfer of a total of 1036 cloned embryos yielded 52 fetuses and piglets, a cloning efficiency of 5%. Twelve of 52 fetuses and piglets (23.1%) were transgenic. Recloning with pffs derived from pCAGGSEhA20-IRESNEO-transgenic fetuses resulted in 3 out of 4 pregnant recipients (75%). Recloning with pffs from transgenic fetuses resulted in a cloning efficiency of 2.3%. Nine cloned transgenic piglets were born. 3) Transfection of pffs with the pEF1/HisAhA20 construct resulted in 33 resistant cell colonies. Nine of the colonies were selected for SCNT. Embryos were transferred to 4 recipients and three pregnancies were established (75%). A total of 375 cloned embryos resulted in fifteen fetuses and piglets, representing a cloning efficiency of 4%. Twelve out of the fifteen progeny had integrated the expression vector (80%). Recloning sessions with pffs derived from pEF1/HisAhA20-transgenic fetuses resulted in pregnancies in two out of three recipients (66.6%). Cloning efficiency after recloning was 1.5% (four born piglets). 4) Transgenic animals were analysed for mRNA and protein expression of hA20 by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), Real-time PCR, Northern blotting, immunohistochemical staining and Western blotting. HA20 was expressed in skeletal muscle, heart, and importantly in freshly isolated and cultivated porcine aortic endothelial cells (PAECs) in pCAGGSEhA20-IRESNEO transgenic pigs. 5) Functional in vitro assays using cultivated PAECs, revealed that the hA20-transgenic PAECS were protected against apoptotis after challenge with human tumor necrosis factor alpha (hTNF-α) compared with wildtype cells. No significant differences were observed in the expression of selected endothelial activation markers, such as intercellular adhesion molecule-I (ICAM-I), vascular adhesion molecule-I (VCAM-I) and E-selectin after exposure to hTNF-α. 6) Four hA20 porcine hearts were evaluated in an ischemia-reperfusion injury model and compared with three wildtype controls. Subendocardial segment shortening (SES) was significantly different between the two groups. The hA20-transgenic animals showed better cardiac performance than wildtype animals. This is the first study reporting the production of hA20-transgenic pigs, which represent an important step in the production of multi-transgenic pigs for use in xenotransplantation experiments. The hA20 transgenic piglets developed normally. Improvements may be obtained with improved expression vectors to target hA20 expression to the endothelial cell layer. Encouraging results were obtained with respect to cloning efficiency, which ranged between 1.5 and 5% depending on the donor cells. These results were above the normal cloning efficiency in pigs which does not exceed ~1%. Cells and tissue from pigs expressing hA20 were subjected to in vitro and in vivo functional tests and results partially confirmed previously published results. Overall the results of this thesis demonstrate that A20 is an important candidate gene for future xenotransplantation research. The next step will involve production of multi-transgenic pigs on the basis of an α 1,3-galactosyltransferase gene knockout. These pigs should control both hyperacute rejection (HAR) and acute vascular rejection (AVR) by transgenic expression of hA20.

Ziel dieser Arbeit war die Produktion von hA20-transgenen Schweinen, die verbesserte Eigenschaften für die Xenotransplantation aufweisen. Die erste Phase des Projekts umfasste die Herstellung von 2 hA20-Expressionsvektoren (pCAGGSEhA20-IRESNEO und pEF1/HisAhA20). Anschließend wurden porzine fetale Fibroblasten (pfF) isoliert und mit einem der beiden Expressionsvektoren transfiziert. In der dritten Versuchsphase wurde mit hA20-transgenen Donorzellen geklont. Schließlich wurden Feten und Ferkel auf hA20-Expression und Funktionalität des Transgens untersucht. Folgende Resultate wurden erarbeitet: 1) Zwei hA20-Expressionsvektoren wurden erstellt, und ausreichende Mengen von beiden Vektoren wurden für Transfektionsversuche bereitgestellt. 2)  Transfektionen mit pCAGGSEhA20-IRESNEO resultierten in 82 Zellkolonien. Fünf davon wurden in Klonversuchen verwendet. Insgesamt wurden 9 von 12 Empfängern trächtig (75%); aus 1036 übertragenen geklonten Embryonen resultierten 52 Nachkommen. Damit konnte eine Kloneffizienz von 5% erzielt werden. Von den 52 Nachkommen waren 12 transgen (23,1%). PfF von transgenen Feten wurden in Klonversuchen erneut eingesetzt und 3 von 4 Embryotransfers resultierten in Trächtigkeiten (75%). Die Kloneffizienz lag bei 2,3% und 9 transgene Ferkel wurden geboren. 3) Eine PfF-Transfektion wurde mit dem Vektor pEF1/HisAhA20 durchgeführt. Daraus resultierten 33 Zellkolonien. Neun davon wurden für das Klonen ausgewählt. Insgesamt wurden 3 von 4 möglichen Trächtigkeiten erzielt (75%). Aus 375 übertragenen geklonten Embryonen resultierten 15 in Nachkommen. Damit konnte eine Kloneffizienz von 4% erzielt werden. Von den 15 Nachkommen waren 12 transgen (80%). PfF von transgenen Feten wurden erneut im Klonen eingesetzt und 2 von 3 Embryotransfers resultierten in Trächtigkeiten (66,6%). Die Kloneffizienz lag bei 1,5%; 4 transgene Ferkel wurden geboren. 4) Transgene Tiere wurden mit Hilfe von RT-PCR, Real-Time PCR, Northern Blot, immunohistochemischen Analysen und Western Blot auf das hA20-Expressionsmuster untersucht. Der Expressionsvektor pCAGGSEhA20-IRESNEO zeigte Expression von hA20 in quergestreifter Muskel, Herz, sowie frisch isolierten und kultivierten porzinen Endothelzellen der Aorta (PAECs). Der Vektor pEF1/HisAhA20 wurde nicht exprimiert. 5) Funktionelle Analysen, die in vitro mit kultivierten PAECs durchgeführt wurden, zeigten, dass hA20-transgene PAEC, in Gegenwart von hTNF-α, eine signifikant niedrigere Apoptoserate als die Wildtypkontrollen aufwiesen. Keine signifikanten Unterschiede wurden bezüglich der Expression der Endothelzell-Aktivierungsmarker ICAM-I, VCAM-I und E-Selektin gefunden. 6) Im Ischämie-Reperfusions-Modell wurden Herzen von 4 hA20-transgenen und 3 Wildtypschweinen getestet. Es konnten signifikante Unterschiede in subendocardial segment shortening (SES) nachgewiesen werden, wo hA20-transgene Tiere verbesserte kontraktile Herzleistungen aufwiesen. Für die restlichen untersuchten Parameter (Myeloperoxidase-Aktivität und Infarktgrösse) wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden. Dies ist die erste Studie, die über die Produktion und Charakterisierung von hA20-transgenen Schweinen berichtet. Die Ergebnisse sind ein wichtiger Fortschritt für die Produktion transgener Schweine für Xenotransplantationsexperimente. Die Ferkel zeigten eine normale Entwicklung. Die Ergebnisse zeigen zudem, dass der Bedarf an optimalen Promotorelementen für die Produktion von transgenen Schweinen hoch ist. Die Kloneffizienz lag zwischen 1,5 und 5% je nach Donorzelle. Diese Ergebnisse liegen über den sonst erzielten Resultaten von ~1%. HA20 transgene Zellen und Gewebeproben bzw. Organe wurden in vitro and in vivo funktionellen Tests unterzogen, und die Ergebnisse konnten publizierte Resultate in anderen biologischen Systemen teilweise bestätigen. Die Ergebnisse zeigen, dass A20 ein interessantes Kandidatengen für die zukünftige Xenotransplantationsforschung ist. Es sollte bei der Generierung von multi-transgenen Schweinen auf der Basis von α1,3-Galaktosyltransferase Knockout-Schweinen mit einbezogen werden. Daraus könnten Schweineorgane resultieren, die sowohl die HAR als auch die AVR positiv beeinflussen.

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Oropeza, Marianne: Production of hA20-transgenic pigs by somatic cell nuclear transfer for xenotransplantation research. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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