Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Biochemical and physiological aspects of volume regulation in immature and mature bovine spermatozoa

Sahin, Basak Evrim

Mammalian spermatozoa experience significant osmotic changes during their life span, both during ejaculation as well as during the transport in the female genital tract. Mature sperm possess a mechanism to maintain their volume and to regulate it after initial swelling following exposure to hypoosmotic conditions, named regulatory volume decrease (RVD). In rodents and primates RVD appears to be acquired during epididymal maturation, but in large domestic animals this aspect has not yet been examined. The aim of this study was to establish an optimal experimental system for physiological studies on cell volume of epididymal sperm and to investigate 1) whether bull epididymal spermatozoa are able to regulate their volume 2) whether this ability differs between caput and cauda epididymal spermatozoa and 3) whether bovine Fn2-module-containing proteins play a role in acquisition of volume regulation ability during sperm maturation. Sperm volumes were measured by electronic cell sizing; evaluation of plasma and acrosomal membranes integrities were performed using flow cytometry. It has been shown that the recovery and incubation in the medium isotonic with caudal epididymal plasma result in better viability and volume regulatory ability of epididymal spermatozoa than conventional system of media isotonic with seminal plasma, or seminal plasma itself. This experimental system was used for subsequent physiological studies. Two subpopulations were observed in volume distributions of caput and cauda epididymal spermatozoa, characterized by differing ability to swell in response to hypotonic conditions. Both sperm subpopulations in caput as well as in cauda were able to undergo RVD. Caput epididymal spermatozoa had a higher cell volume under isotonic conditions compared to cauda epidiymal spermatozoa. Substitution of sodium and chloride by choline and sulfate resulted in a decreased caput spermatozoa isotonic volume. Furthermore, the differences abolished between caput and cauda epididymal spermatozoa. The results of the present study indicate that uptake of Na+ and Cl- ions is less controlled in caput epididymal spermatozoa than in cauda, probably due to premature activation of transport mechanisms. Thus, although spermatozoa from the caput epididymidis are able to undergo RVD after hypotonic challenge, the mechanisms controlling ion transport under isotonic conditions are not fully developed. To clarify this mechanism, the role of sperm binding Fn2-module-containing proteins was investigated. Mainly two classes exist which differ by having either two Fn2 modules, as the major member BSP-A1/2 (small Fn2 protein), or having four Fn2 modules such as ELSPBP1 (long Fn2 protein). The first two modules have similar three-dimensional structures. Both proteins bind to the sperm through interaction with phosphorylcholine. It is shown that long Fn2 protein (ELSPBP1) is present in the caput, corpus and cauda regions of the bull epididymis whereas it binds to the spermatozoa during their transit through the epididymis; it was detected in mature (cauda) spermatozoa but not in immature (caput) epididymal spermatozoa. Small Fn2 proteins (BSP-A1/2) bind to spermatozoa upon ejaculation. Both the long and the small Fn2 proteins are essentially localized in the head and midpiece regions of mature bovine spermatozoa. These common features suggest similar functions; therefore, BSP-A1/2 was used as a model protein. Cauda epididymal spermatozoa showed progressive volume regulation both in the absence and presence of BSP-A1/2. The protein treatment caused caput epididymal spermatozoa to swell more in response to hypotonic stress after 5 min and to regulate their volume after 20 min incubation in a similar fashion to cauda epididymal spermatozoa. It is suggested that BSP-A1/2 affects the premature activation of transport mechanisms (such as ion channels, for example). The premature activation of these channels could lead to uncontrolled uptake of Na+ and Cl- ions. This uptake and coupled water transport is the likely cause of elevated isotonic volume levels in caput spermatozoa. At the same time, this premature activation accounts for the accelerated response to hypotonic challenge as the osmotically induced volume-sensitive response would be initiated faster. BSP-A1/2 possibly deactivates this premature activation. Therefore, the response to hypotonic conditions becomes slower and the relative volumes in caput epididymal spermatozoa match those in cauda epiddiymal spermatozoa. In conclusion, this study has provided further insights into the mechanism of spermatozoa volume regulation during epididymal maturation. A new superior experimental system was established for physiological volume regulation studies in bovine epididymal spermatozoa. Caput epididymal spermatozoa are able to undergo RVD after hypotonic challenge. However, the mechanisms controlling ion transport under isotonic conditions are not fully developed compared to cauda epididymal (mature) sperm. It seems highly probable that the attachment of long Fn2 protein to the maturing spermatozoa has a regulatory effect on cell volume control as they pass down the epididymis. For the first time, long Fn2 protein was detected in bovine epididymis and its contribution to volume regulation of maturating epididymal spermatozoa is discussed.

Spermatozoen werden bei der Ejakulation und nach der Deponierung im weiblichen Genitaltrakt mit hypotonen Bedingungen konfrontiert, da Seminalplasma und uterine Flüssigkeit eine niedrigere Osmolalität aufweisen als die epididymale Flüssigkeit. Die hypotone Belastung führt zu einer primären Schwellung der Spermien. Reife Spermatozoen besitzen einen Mechanismus, um diese primäre Schwellung der Zelle wieder aufzuheben. Dieser Prozess der regulatorischen Volumenabnahme unter hypotonen Bedingungen wird als RVD („Regulatory Volume Decrease“) bezeichnet. Bei Nagetieren und Primaten wird vermutet, dass die Fähigkeit zum RVD während der Nebenhodenreifung erlangt wird; bei Nutztieren ist dieser Aspekt jedoch noch nicht hinreichend untersucht worden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein optimiertes System für physiologische Studien bei Nebenhodenspermien etabliert, um die folgenden Fragen beantworten zu können: 1) Besitzen Nebenhodenspermien von Bullen die Fähigkeit zur Volumenregulation? 2) Unterscheidet sich die Fähigkeit zur Volumenregulation zwischen Nebenhodenkopf- und Nebenhodenschwanzspermien? 3) Sind bovine Fn2-Proteine an dem Erwerb der Volumenregulationsfähigkeit der Spermien beteiligt? Die Bestimmung des Zellvolumens erfolgte mit Hilfe des elektronischen Partikelzählers CASY 1; die Integritäten von Plasmamembran und Akrosom wurden durchflusszytometrisch ermittelt. Wurde für die Gewinnung und Inkubation der Nebenhodenspermien ein Medium verwandt, das isoosmotisch zum Plasma des Nebenhoden-schwanzes war, so wurden im Vergleich zu konventionellen Medien (isoosmotisch zum Seminalplasma oder Seminalplasma selbst) eine höhere Vitalität und eine bessere Fähigkeit zur Volumenregulation der Nebenhodenspermien erzielt. Daher wurde für die folgenden physiologischen Studien ein zum Plasma des Nebenhodenschwanzes isoosmotisches Medium eingesetzt. Die Volumenverteilungen von Nebenhodenkopf- und Nebenhodenschwanzspermien zeigten zwei Subpopulationen, die durch ihre unterschiedliche Schwellungsfähigkeit unter hypotonen Bedingungen gekennzeichnet waren. Beide Subpopulationen von Nebenhodenschwanz- und Nebenhodenkopfspermien zeigten eine RVD. Die Nebenhodenkopfspermien hatten gegenüber den Nebenhodenschwanzspermien ein höheres Zellvolumen unter isotonen Bedingungen. Durch den Austausch von Natrium und Chlorid gegen Cholin und Sulfat im Medium verringerten sich die Volumina der Nebenhodenkopfspermien unter isotonen Bedingungen; zudem waren keine Unterschiede zwischen Nebenhodenschwanzspermien und Nebenhodenkopfspermien feststellbar. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass die Aufnahme von Na+- und Cl--Ionen bei Nebenhodenkopfspermien, möglicherweise infolge frühzeitiger Aktivierung von Transportmechanismen, weniger kontrolliert erfolgt als bei Nebenhodenschwanzspermien. Obwohl Nebenhodenkopfspermien nach hypotoner Belastung eine RVD zeigen können, ist der Mechanismus, der den Ionen-Transport unter isotonen Bedingungen kontrolliert, noch nicht ausgereift. Zur Aufklärung des zugrunde liegenden Mechanismus wurde die Beteiligung der Fn2-Modul-Proteine untersucht. Hauptsächlich sind zwei Klassen der Proteine vorhanden, die sich durch Anzahl der Fn2-Module unterscheiden. Kurze Fn2-Modul-Proteine (BSP-A1/2) besitzen zwei Fn2-Module, während lange Fn2-Modul-Proteine, wie ELSPBP1, vier Fn2-Module besitzen. Die ersten zwei Module beider Proteine haben vergleichbare dreidimensionale Strukturen. Beide Proteine binden an das Spermatozoon durch die Interaktion mit Phosphorylcholin. Diese gemeinsamen Eigenschaften deuten auf ähnliche Funktionen hin. Deshalb wurde BSP-A1/2 als Modellprotein verwendet. Nebenhodenschwanzspermien zeigten mit und ohne Zugabe von BSP-A1/2 eine osmotisch-induzierte Volumenregulation. Nach der Zugabe des Proteins zeigten die Nebenhodenkopfspermien erhöhte Schwellungsreaktion nach 5 Minuten und erhöhte nominelle RVD nach 20 Minuten. Beide Reaktionen waren mit denjenigen von Nebenhodenschwanzspermien vergleichbar. Es wird daher angenommen, dass BSP-A1/2 die frühzeitige Aktivierung von Transportmechanismen (bzw. Ionenkanälen) beeinflussen kann und letztere zu einer unkontrollierten Aufnahme von Na+- und Cl--Ionen führt. Ein an diese Aufnahme gekoppelter Wassertransport könnte die zu den größeren Zellvolumina der Nebenhodenkopfspermien nach Inkubation in isotonen Medien geführt haben. Gleichzeitig ist diese vorzeitige Aktivierung für die beschleunigte Reaktion gegenüber hypotonem Stress verantwortlich, da die osmotisch induzierte volumen-sensitive Reaktion vermutlich schneller eingeleitet wird. BSP-A1/2 deaktiviert offenbar diese frühzeitige Aktivierung der Ionenkanäle. Folglich wird die Reaktion unter hypotoner Belastung langsamer und die Volumina der Nebenhodenkopf- stimmen mit denen der Nebenhodenschwanzspermien überein. Es lässt sich schlussfolgern, dass die Gewinnung und Inkubation in einem Medium, das isosmotisch zu dem Plasma des Nebenhodenschwanzes (360mOsm kg-1) ist, eine geeignete Methode zur Durchführung physiologischer Studien über Volumenregulationsprozesse bei epididymalen Spermien darstellt. Nebenhodenkopfspermien sind in der Lage, auf hypotonen Stress mit einer regulatorischen Volumenabnahme zu reagieren. Dennoch ist im Vergleich zu Nebenhodenschwanzspermien der Kontrollmechanismus des Ionentransportes unter isotonen Bedingungen noch nicht ausgereift. Das lange Fn2 Protein bindet sich während der Passage der reifenden Spermatozoen durch den Nebenhoden an das Phosphorylcholin der Spermienmembran und übt so vermutlich einen regulierenden Effekt auf die Kontrolle des Zellvolumens aus. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig langes Fn2 Protein im bovinen Nebenhoden entdeckt und seine Beteiligung an der Volumenregulationsfähigkeit reifender epididymaler Spermien beschrieben.

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Sahin, Basak Evrim: Biochemical and physiological aspects of volume regulation in immature and mature bovine spermatozoa. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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