Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

In vitro Expressions-Analyse von Transkriptionsfaktoren muriner Astrozyten und Mikrogliazellen nach Infektion mit dem Theiler-Enzephalomyelitis-Virus

Gerhauser, Ingo

Theiler’s murine encephalomyelitis (TME) and canine distemper represent important virus-induced animal models for demyelinating diseases in humans including multiple sclerosis. Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) persists in the spinal cord of susceptible SJL/J mice. In contrast, a strong antiviral response eliminates the virus from the central nervous system (CNS) in resistant C57BL/6 mice. Virus persistence leads to permanent stimulation of the immune system thereby causing demyelination. Astrocytes, microglia, and invading immune cells are deeply involved in this process by producing and secreting different cytokines and matrix-metalloproteinases (MMPs). Ets-1, NF-kB (p50/p65), AP-1 (c-jun/c-fos), Max, and p53 are interacting transcription factors, which are activated during different inflammatory processes. They control the production of various messenger and effector molecules and influence cellular proliferation, differentiation, and apoptosis. However, studies comparing the cell-specific expression of these transcription factors in astrocytes and microglia as well as their role in the pathogenesis of TME are lacking. In the present study primary astrocytes and microglia were isolated from the brain of neonatal SJL/J mice, seeded in a mono- or co-culture system, and subsequently infected with TMEV. Absolute cell numbers as well as percentage of GFAP-positive astrocytes, DiI-LDL/Iba-1-positive microglia, and TMEV-positive cells were determined 6, 48, 72, 240 hours after infection. Plaque assays were done to calculate plaque forming units (PFU)/ml in the cell culture supernatant. The mRNA of the cells was isolated and used in a quantitative RT-PCR (RT-qPCR) to measure transcript numbers of Ets-1, p50, p65, c-jun, c-fos, Max, p53, TNF, IFN-g, MMP-2, MMP-3, MMP-9 and MMP-12. Additionally, cell proliferation and apoptosis rate of the TMEV-infected astrocytes were determined by using a BrdU assay and fluorescent labeled antibodies specific for cleaved caspase-3, respectively. Virus replication in microglia was investigated by quantifying the minus-strand RNA of TMEV. The study revealed a reduction of the proliferation rate of TMEV-infected cells and indicated a virus-induced apoptosis of astrocytes. Virus replication was extremely repressed in microglia compared to astrocytes. Sham-infected astrocytes showed statistically significant higher numbers of Ets-1 and MMP-2 mRNS transcripts compared to sham-infected microglia. In contrast, there was a stronger expression of TNF, p50, and p53 in sham-infected microglia compared to sham-infected astrocytes. Furthermore, sham-infected microglia demonstrated a more than 100 times stronger expression of MMP-9 and MMP-12 compared to sham-infected astrocytes. The differences between these two glial cell lines in the basal expression of Max, p65, c-jun, c-fos, and MMP-3 were restricted to the mono- or coculture. The cytokine IFN-g was not detected in any of the investigated cell cultures. RT-qPCR results pointed to a participation of the NF-kB-protein p50 in the TMEV-induced expression of TNF. However, siRNA inhibition of this protein yielded no influence on the transcription rate of TNF. Therefore, lack of p50 seems to be functionally compensated by other transcription factors including different AP-1-proteins, which are involved in cytokine expression. Interestingly, TNF can itself activate various transcription factors during its signal transduction cascade. Consequently, the increase in the expression of c-fos in the TMEV-infected microglia might be induced by high TNF levels. Both investigated cell types showed positive correlations between Max, p50, p65, c-jun, c-fos, p53 and TNF. These correlations can be explained by the well-known influence of the interacting NF-kB-, AP-1-, and Max-proteins on the transcription of p53, which might be induced by TNF. Furthermore, an increase in the expression of p53 might have caused the observed inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis of astrocytes and microglia. In contrast, the slight but statistically significant increase in the expression of Max in the TMEV-infected microglia might represent a way of these cells to protect themselves against a TMEV-induced apoptosis. Though the expression of MMP-2 in astrocytes was only insignificantly influenced by TMEV-infection, MMP-3, MMP-9 and MMP-12 were strongly upregulated in TMEV-infected astrocytes. However, transcription of MMP-9 is inhibited in vivo by IFN-g, which is released by inflammatory cells during the demyelination process. A strongly reduced expression of MMP-3, MMP-9 and MMP-12 was found in TMEV-infected microglia. These results substantiate the prominent role of astrocytes in the demyelination process of TME by releasing different MMPs, which can destroy the blood-brain-barrier and myelin sheath components. Astrocytes and microglia show considerable differences in their reaction pattern to TMEV-infection. In addition, the investigated transcription factors seem to play an important role in the pathogenesis of TME. However, further studies are needed to elucidate the cell-type specific function of these interacting transcription factors in vivo.

Die murine Theilervirus-Enzephalomyelitis (“Theiler’s murine encephalomyelitis“; TME) stellt neben der kaninen Staupe ein bedeutendes, virusinduziertes Tiermodell für demyelinisierende Erkrankungen wie die multiple Sklerose des Menschen dar. Während das Theilervirus (“Theiler’s murine encephalomyelitis virus“; TMEV) im Rückenmark von empfänglichen SJL/J-Mäusen persistiert, wird es aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) von resistenten C57BL/6-Mäusen durch eine starke antivirale Immunantwort eliminiert. Die Viruspersistenz führt zu einer ständigen Stimulation des Immunsystems mit daraus folgender Demyelinisierung. Neben den einwandernden Entzündungszellen sind Astrozyten und Mikroglia durch die Freisetzung von Zytokinen und Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) am Entmarkungsprozess beteiligt. Ets-1, NF-kB (p50/p65), AP-1 (c-jun/c-fos), Max und p53 sind interagierende Transkriptionsfaktoren, die im Rahmen von unterschiedlichen Entzündungsprozessen aktiviert werden und die Produktion von verschiedenen Botenstoffen und Effektormolekülen kontrollieren. Außerdem haben dieser Transkriptionsfaktoren einen entscheidenden Einfluss auf die Proliferation, Differenzierung und Apoptose von Zellen. Allerdings fehlen vergleichende Studien über die spezifischen Expressionsmuster dieser Transkriptionsfaktoren in Astrozyten und Mikroglia sowie deren Verbindung zur Pathogenese der TME. Im Rahmen dieser Studie wurden primäre Astrozyten und Mikroglia aus Gehirnen neonataler SJL/J-Mäuse gewonnen, in Mono- und Kokultur ausgesät und anschließend mit TMEV infiziert. 6, 48, 72, 240 Stunden nach der Infektion wurden die Zellzahl und mittels Immunfluoreszenz der Prozentsatz GFAP-positiver Astrozyten, DiI-LDL/Iba-1-positiver Mikroglia und TMEV-positiver Zellen in den einzelnen Kulturen bestimmt. Ein Plaquetest diente zur Bestimmung der “Plaque Forming Units“ (PFU)/ml im Zellkulturüberstand. Die mRNS wurde aus den Zellen für eine quantitative RT-PCR (RT-qPCR) isoliert und die Genexpression von Ets-1, p50, p65, c-jun, c-fos, Max, p53, TNF, IFN-g, MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 bestimmt. In weiterführenden Untersuchungen wurde die Proliferations- und Apoptoserate von Astrozyten nach der TMEV-Infektion mittels BrdU-Test bzw. “cleaved“ Caspase-3 spezifischer Immunfluoreszenz ermittelt. Die Virusreplikation in Mikroglia wurde mittels Quantifizierung der TMEV-Minus-Strang-RNS genauer untersucht. Die Untersuchungen der aufgereinigten Kulturen ergaben eine Hemmung der Proliferationsrate der TMEV-infizierten Zellen. Des Weiteren wurde eine virusinduzierte Apoptose von Astrozyten beobachtet. Im Gegensatz zu den Astrozyten wies die Mikroglia eine extrem eingeschränkte Virusreplikation auf. In den Astrozyten wurde gegenüber der Mikroglia eine statistisch signifikant stärkere basale Genexpression von Ets-1 und MMP-2 nachgewiesen. Dagegen wurden in der Mikroglia mehr mRNS-Transkripte von TNF, p50 und p53 als in den Astrozyten festgestellt. Außerdem wurden MMP-9 und MMP-12 über 100-fach stärker in Mikroglia als in Astrozyten exprimiert. Bei Max, p65, c-jun, c-fos und MMP-3 lagen lediglich auf die Mono- oder Kokultur beschränkte Unterschiede zwischen diesen beiden Zelltypen bezogen auf die basale Genexpression vor. Das Zytokin IFN-g war in keiner der untersuchten Zellkulturen nachweisbar. Die Ergebnisse der RT-qPCR deuten auf eine Beteiligung des NF-kB-Proteins p50 bei der TMEV-induzierten TNF-Expression hin. Dennoch hatte eine Hemmung der Genexpression von p50 mittels siRNS keinen Einfluss auf die Transkriptionsrate von TNF, so dass ein Fehlen dieses Proteins zumindest teilweise durch andere Transkriptionsfaktoren ausgeglichen werden kann. So wird die Genexpression verschiedener Zytokine vermutlich ebenfalls durch AP-1-Proteine kontrolliert. Interessanterweise kann TNF selbst verschiedene Transkriptionsfaktoren im Rahmen der Signaltransduktionskaskade aktivieren, so dass der Anstieg der Genexpression von c-fos in der TMEV-infizierten Mikroglia möglicherweise durch TNF induziert wurde. Des Weiteren wurden positive Korrelationen zwischen Max, p50, p65, c-jun, c-fos, p53 und TNF in beiden untersuchten Zelltypen festgestellt. Diese lassen sich durch den Einfluss der interagierenden NF-kB-, AP-1- und Max-Proteine auf eine TNF-induzierte sowie p53-vermittelte Proliferationshemmung und/oder Apoptose von Astrozyten und Mikroglia erklären. Außerdem stellt der leichte aber statistisch signifikante Anstieg der Genexpression von Max in der Mikroglia nach der TMEV-Infektion möglicherweise eine Schutzreaktion dieser Zellen vor einer TMEV-induzierten Apoptose dar. Während die Genexpression von MMP-2 in den Astrozyten kaum durch die TMEV-Infektion beeinflusst wurde, war die Genexpression von MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in den TMEV-infizierten Astrozyten stark aufreguliert. Hierbei muss jedoch berücksichtigt werden, dass in vivo die Transkription von MMP-9 durch im Rahmen der Entzündung freigesetztes IFN-g unterdrückt wird. Im Gegensatz dazu wies die Mikroglia eine eindeutig verminderte Genexpression dieser drei MMPs nach der TMEV-Infektion auf. Diese Ergebnisse belegen die herausragende Rolle der Astrozyten für den Entmarkungsprozess der TME, an dem MMPs durch die Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke und der Myelinscheiden beteiligt sind. Astrozyten und Mikroglia weisen deutliche Unterschiede in der Reaktion auf eine TMEV-Infektion auf. Außerdem scheinen die untersuchten Trankriptionsfaktoren eine wichtige Rolle in der Pathogenese der TME zu spielen. Dennoch werden weitere Studien benötigt, um die genaue zellspezifische Bedeutung dieser interagierenden Transkriptionsfaktoren in vivo aufzuklären.

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Gerhauser, Ingo: In vitro Expressions-Analyse von Transkriptionsfaktoren muriner Astrozyten und Mikrogliazellen nach Infektion mit dem Theiler-Enzephalomyelitis-Virus. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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