Genetische Charakterisierung von europäischen Fledermaustollwutviren in Deutschland und Untersuchungen zu ihrer spatiotemporalen Diversität

Freuling, Conrad Martin

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Genetische Charakterisierung von europäischen Fledermaustollwutviren in Deutschland und Untersuchungen zu ihrer spatiotemporalen Diversität

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Bisherige Untersuchungen von deutschen Fledermaustollwutvirusisolaten wiesen ausnahmslos European Bat Lyssavirus Typ 1 (EBLV-1) nach. Mithilfe eines Raster-basierten Ansatzes wurden 48 Fledermaustollwutvirusisolate aus Deutschland repräsentativ ausgewählt und durch die direkte Sequenzierung des N-Gens, und der nicht-translatierte Bereiche zwischen dem N und P-Gen (NP-NTR) bzw. dem G und L-Gen (GL-NTR) vergleichend charakterisiert. Die Ergebnisse bestätigten vorangegangene Studien an EBLV-1 Isolaten, wonach die Sequenzen innerhalb dieses Genotyps eine hohe Identität aufweisen, was auf eine große Stabilität des Genoms bei der Viruszirkulation schließen lässt. Es konnte jedoch erstmals gezeigt werden, dass bestimmte genetische Cluster der EBLV-1 Viruspopulation in Deutschland auch räumlich gehäuft auftreten. Alle drei untersuchten Genabschnitte konnten dabei zur Unterscheidung in die beiden zirkulierenden Subtypen 1a und 1b genutzt werden. Die größtmögliche Differenzierung wurde bei Verwendung der N-Gensequenzen erreicht. Anders als von RABV erwartet, war die Variabilität der GL-NTR nicht ausreichend für detaillierte phylogenetische Analysen. Interessanterweise konnten im NP-NTR bei zwei Isolaten eine 6 nt-Insertion bzw. bei einem Isolat eine 2 nt-Insertion nachgewiesen werden. Zudem wurde bei einem Isolat eine Deletion von 35 nt im GL-NTR festgestellt. Die Folgen dieser Mutationen auf virale Eigenschaften sind Gegenstand weiterer Untersuchungen, da diese bei Lyssaviren zuvor noch nicht beschrieben worden waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals der Nachweis von EBLV-2 bei einer Wasserfledermaus im Süden Deutschland erbracht. Der Vergleich der Sequenzen von 400 nt des N-Gens zeigt hohe Identität mit Isolaten aus der angrenzenden Schweiz und gibt Hinweise auf einen epidemiologischen Zusammenhang im Infektionsgeschehen. Um die betroffene Fledermausspezies eindeutig identifizieren zu können, wurde eine partielle Sequenzierung des cytochrom-B-Gens durchgeführt, und in die Fledermaustollwutdiagnostik am NRL etabliert.

Previous studies on German EBLV isolates confirmed the presence of EBLV-1, and a preliminary epidemiological study indicated a distinct geographical distribution of EBLV-1 in Germany. Using a random grid sampling procedure based on GIS, 48 isolates were selected to further investigate the spatial and temporal distribution of EBLV-1 variants in Germany. The nucleoprotein-gene (N), the nucleoprotein-phosphoprotein spanning untranslated region (NP-UTR) and the UTR between G and L-gene of each isolate were sequenced using direct cycle sequencing. Results of the subsequent phylogenetic analysis of the N-gene confirmed previous studies on European EBLVs, showing a high sequence identity among German EBLV-1a isolates. This indicates genomic stability of the virus during the transmission cycle. However, when combining the data sets for geographic origin and phylogeny, clustering of isolates became evident. The gene fragments studied were shown to be suitable for distinguishing between the circulating EBLV subtypes 1a and 1b. The best differentiation, however, was seen when analysing sequences of the complete N-gene. The variability of the GL-region was not sufficient for the discrimination of clusters, an unexpected finding in respect to studies on RABV. Interestingly, 6 bp insertions in two isolates as well as a single nucleotide insertion in a different isolate were detected in the N-P UTR. Within the UTR between G and L-gene one isolate showed a 35 pb deletion. The effect of those changes on viral properties remains elusive as such mutations had not been described for lyssaviruses before. For the first time the presence of EBLV-2 was confirmed in a daubenton’s bat from the South of Germany. Partial sequencing of the N-gene revealed a high degree of identity with other EBLV-2 isolates from Switzerland, suggesting epidemiological association. To identify the species of the bat involved, sequencing of the partial cytB-gene proved very effective , and the method was established in the NRL.