Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten aus Follikeln mit unterschiedlicher Durchblutung der Follikelwand

Hanstedt, Ana

The aim of this study was to determine whether the perifollicular blood flow is a useful parameter to select cumulus-oocyte-complexes (COC) of high developmental competence. Twenty-six ovum pick up (OPU) sessions were performed once and twice weekly. The follicular fluid containing the COC was aspirated seperately with regard to their different perifollicular blood flow. The verification of the usefulness of this parameter was based on assessment of developmental competence as 318 aspirated COC were used in an IVP-system. Furthermore on a molecular level where the relative transcript abundance of different developmentally important genes was measured in 39 oocytes gained through OPU and 24 blastocysts from in vitro production (IVP). Additionally it was assessed whether the perifollicular blood flow correlates with the ability of the follicle to produce steroid hormones in order to reflect its health status. The following results were obtained: On a weekly basis the number of recovered oocytes by OPU is significantly higher if sessions are performed twice rather than once a week (8.6 and 5.4 follicles per week, respectively, P ≤ 0.05). Elongation of the intervals between OPU sessions from 3 - 4 days to 7 days results in significantly more large follicles (> 8 mm) on the ovary (33.6 % and 63.5 % of follicles > 8 mm, respectively, P ≤ 0.05). Larger follicles (> 8 mm) significantly more often show a perifollicular blood than the smaller follicles (≤ 8 mm) do (43.0 % and 83.8 % of follicles showed perifollicular blood flow, respectively P ≤ 0.05). Follicles without perifollicular blood flow produce a COC with expanded cumulus cells significantly more often than those with perifollicular blood flow (8.8 % and 3.2 % of COC with expanded cumulus, respectively P ≤ 0.05). It is very possible that these follicles and the containing oocytes are atretic. The retrieval of COC by OPU sessions once a week from follicles without perifollicular blood flow has a significantly negative influence on the developmental competence of these COC in vitro (P ≤ 0.05). The relative transcript abundance of the ZAR1, BMP15, GDF9, DNMT1A, DNMT3A and HDAC2 in immature oocytes recovered in weekly intervals from follicles without perifollicular blood flow was significantly lower than in those that were obtained twice weekly out of follicles without perifollicular blood flow (P ≤ 0.05). The relative transcript abundance of the G6PD gene in blastocysts that developed out of COC from follicles without perifollicular blood flow was significantly lower if they were gained by OPU sessions once instead of twice weekly (P ≤ 0.05). Differing perifollicular blood flow had an influence on the relative transcript abundance of 6 of 8 genes in immature oocytes but only in 1 of 8 genes in blastocysts obtained from such oocytes. In conclusion the perifollicular blood flow is a useful parameter during OPU sessions to select oocytes of higher quality, if sessions are performed once weekly.

In dieser Arbeit wurde der Parameter der per Ultraschall gemessenen qualitativen Follikeldurchblutung auf seine Fähigkeit zur Selektion qualitativ hochwertigerer Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) überprüft. Dazu wurden Ovum pick up- (OPU) Sitzungen in den Intervallen von 3 - 4 bzw. 7 Tagen durchgeführt, während derer die Durchblutung protokolliert und danach separiert nach dem Status der Follikelwanddurchblutung der KOK aufgefangen wurden. Die Überprüfung des Parameters auf seine Selektionsfähigkeit fand auf Basis der Entwicklungskompetenz in der In-vitro-Produktion (IVP) und auf der mRNA-Ebene statt. Die relativen Transkriptgehalte entwicklungsrelevanter Gene wurden in Oozyten und Blastozysten gemessen. Weiterhin wurde überprüft, ob die per Ultraschall erkennbare Durchblutung eine Korrelation mit der hormonellen Aktivität und damit dem Gesundheitsstatus des Follikels aufweist. Als Ergebnis aus den Untersuchungen lassen sich folgende Erkenntnisse festhalten: Auf wöchentlicher Basis lassen sich per OPU in einem Punktionsintervall von 3 - 4 Tagen signifikant mehr KOK gewinnen als durch Punktionen im 7-Tagesintervall (8,6 bzw. 5,4 Follikel je Woche, P ≤ 0,05). Bei verlängertem Punktionsintervall von 3 - 4 auf 7 Tage befindet sich ein signifikant höherer Anteil an großen Follikeln (> 8 mm) auf den Ovarien der OPU-Tiere (33,6 % bzw. 63,5 % der Follikel > 8 mm, P ≤ 0,05). In den größeren Follikeln (> 8 mm) lässt sich mit der in dieser Untersuchung angewandten Methode signifikant häufiger eine Durchblutung erkennen als in den kleineren Follikeln (43,0 % bzw. 83,8 % der Follikel durchblutet, P ≤ 0,05). Eine nicht erkennbare Follikeldurchblutung geht im Vergleich zur erkennbaren Follikeldurchblutung mit einer signifikant erhöhten Rate an KOK mit expandiertem Kumulus einher (8,8 % bzw. 3,2 % der KOK expandiert, P ≤ 0,05). Die Vermutung liegt nahe, dass diese Follikel und die in ihnen befindlichen Eizellen atretisch sind. Bei der Gewinnung von KOK in einem Intervall von 7 Tagen hat eine nicht erkennbare Durchblutung des Herkunftsfollikels einen signifikant negativen Einfluss auf die Entwicklungskompetenz der KOK in vitro (P ≤ 0,05). Unreife Eizellen aus Follikeln ohne erkennbare Durchblutung, die in einem Punktionsintervall von 7 Tagen gewonnen wurden, zeigten signifikant geringere mRNA-Gehalte für ZAR1, BMP15, GDF9, DNMT1A, DNMT3 und HDAC2A als die der vergleichbaren Gruppe im Punktionsintervall von 3 - 4 Tagen (P ≤ 0,05). Die mRNA-Gehalte von Blastozysten aus KOK deren Herkunftsfollikel keine erkennbare Durchblutung aufzeigten, waren signifikant geringer bezüglich G6PD, wenn sie in einem Punktionsintervall von 7 Tagen statt 3 - 4 Tagen gewonnen wurden (P ≤ 0,05). Auf der mRNA-Ebene zeigte sich in den unreifen Eizellen mit sechs von acht veränderten Genen eine stärkere äußere Beeinflussung als in den Blastozysten, in denen nur eines von acht Genen verändert war. Die allgemeine Schlussfolgerung dieser Arbeit lautet daher, dass bei einem Intervall von 7 Tagen zwischen den OPU-Sitzungen kann die Messung der perifollikulären Durchblutung als ein nutzbarer Parameter angesehen werden, um Oozyten von erhöhter Qualität zu gewinnen.

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Hanstedt, Ana: Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten aus Follikeln mit unterschiedlicher Durchblutung der Follikelwand. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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