Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Echotexturanalyse des Lebergewebes zur nicht-invasiven Bestimmung des Leberfettgehaltes bei Milchkühen

Haudum, Alois

The aim was to develop a method for non-invasive ultrasonographic detection of the liver fat content in dairy cows. For this purpose, transcutaneous brightness mode ultrasonographic images were digitally analysed. In contrast to previous methods, various handling- or equipment-based artefacts, as well as the influence of the abdominal wall on image characteristics of investigated tissues, were considered and corrected. Method preconditions were, amongst others, the knowledge of the actual liver fat content in order to determine a gold standard. For this reason a straightforward, accurate and precise method for detecting total lipid (TL) and triacylglycerol (TAG) content of the liver was developed.   All analyses were carried out on 151 German Holstein cows. All cows suffered from left-sided abomasal displacement and were patients referred to the Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine, Hannover for surgical correction by laparatomy via the right flank (Omentopexy; DIRKSEN (1967). Intraoperatively, a liver sample was taken from the caudal lobe. The liver biopsies of all cows represented the expected liver fat content spectrum (TAG: 4.6 – 292.4 mg/g liver wet weight (FW)) of cows in early lactation. There was no evidence of cows suffering from severe dysfunction of the general condition. Furthermore, ultrasonographic, as well as histopathological examination of the liver confirmed that none of the cows participating in this study suffered from hepatic disorders other than hepatic lipidosis.   The method for analysing the TL and TAG content was developed using liver tissue samples from 10 patients. TL was measured gravimetrically and TAG was determined enzymatically in the TL extract using an automated analyser. The mean coefficient of variance of the TL analysis (N = 10) was 2.2%. The TAG analysis (N = 10) yielded a mean intraday coefficient of variance of 2.5% and a mean interday coefficient of variance of 3.4%. The analytical procedure was accurate, simple and rapid to conduct and therefore represents a suitable method for determining the gold standard.   In a follow-up study, TL and TAG were determined from liver biopsies of 150 German Holstein cows. With increasing TL content in the liver tissue samples of the 150 dairy cows, a linear (r² = 0.97) increase in TAG content was noted. The proportion of TAG relative to TL rose with increasing TL up to a content of approximately 100 mg TL/g FW and subsequently reached a plateau at approximately 70%. This relation could be described accurately with a linear broken-line model. Furthermore, in applying the linear broken line model, the calculation of the TAG from the TL could be further improved (r² = 0.98). Due to the close relationship between TAG and TL (linear: r² = 0.97; broken line: r² = 0.98) both parameters could be used as the gold standard for the liver fat content.   The computer program CAUS (computer-aided ultrasound diagnosis) for quantitative non-invasive detection of the liver fat content was developed using calibrated ultrasonographic images from 12 patients. These images were obtained transcutaneously as well as intraoperatively (in the course of the laparatomy by direct contact with the liver), while TL served as gold standard. The ultrasonographic images were corrected and digitally processed with CAUS. The quantitative comparison of transcuantaneous and intraoperative images enabled correction for attenuation of the abdominal wall. The ultrasonographic parameters correlated well with the TL content (transcutaneous mean echo level vs. TL: r = 0.80; transcutaneous residual attenuation vs. TL: r = 0.69). CAUS therefore provides an opportunity to non-invasively detect the liver fat content in ultrasonographic images with the aid of quantitative echotexture analysis of calibrated brightness mode images.   In the following, the diagnostic accuracy of CAUS was tested on transcutaneously obtained ultrasonographic liver images from 151 patients. The biochemically detected TAG content was hereby used as gold standard. The ultrasonographic parameters mean echo level and residual attenuation correlated well with the TAG content (r = 0.59 and r = 0.80, respectively). Moreover, high mutual correlation existed between residual attenuation and mean echo level (r = 0.76). The 151 studied cows were randomly divided into a training set of 76 cows and a test set of 75 cows. Based on the data from the training set (N = 76), residual attenuation was statistically selected by means of stepwise multiple regression analysis for TAG prediction (r2 = 0.69). Subsequently, using the predicted TAG data of the test set (N = 75), Receiver Operating Characteristic (ROC) analysis was performed to investigate the accuracy and diagnostic reliability of differentiating between various measured TAG values based on TAG predictions from the regression formula. The Area-under-the-Curve (AUC) values of the ROC based on the regression equation were 0.94 (<50 vs. ≥50 mg TAG/g FW), 0.83 (<100 vs. ≥100 mg TAG/g FW) and 0.97 (<50 vs. ≥100 mg TAG/g FW), respectively.   The developed method for non-invasive detection of the liver fat content with CAUS yielded an extremely high diagnostic accuracy to grade the degree of liver TAG infiltration of the examined cows. The automation in the image processing and analysis, in addition to the employment of only one ultrasonographic parameter (residual attenuation) for calculating the TAG content, enables installation of the program CAUS in a conventional ultrasound device. Hence, the requirements for its routine application within herd health management are fulfilled.

Ziel war die Entwicklung einer Methode zur nicht-invasiven sonographischen Bestimmung des Leberfettgehaltes für Milchkühe. Dazu sollten transkutane Brightness-Mode Ultraschallbilder der Leber digital quantitativ ausgewertet werden. Im Unterschied zu bisherigen Verfahren wurden untersuchungs- und gerätebedingte Artefakte sowie der Einfluss der Bauchwand der Tiere vor der Bildanalyse herausgerechnet. Voraussetzung für die Etablierung der Methode war unter anderem die genaue Kenntnis des tatsächlichen Leberfettgehaltes als Goldstandard. Aus diesem Grund wurde eine genaue, einfach und rasch durchführbare Methode zur Totallipid (TL) und Triacylglycerol (TAG) Bestimmung entwickelt.   Sämtliche Untersuchungen wurden an 151 Deutschen Holstein Milchkühen, bei welchen als Patienten der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover eine Dislocatio abomasi sinister diagnostiziert wurde, durchgeführt. Im Zuge der Laparatomie zum Zwecke der Reposition und Fixation des Labmagens (Omentopexie; DIRKSEN 1967) wurde bei allen Tieren eine Lebergewebeprobe entnommen. Die Kühe repräsentierten in den Leberbioptaten das für frühlaktierende Tiere zu erwartende Fettgehaltsspektrum (TAG: 4,6 - 292,4 mg/g  Leberfrischgewicht (FW)). Sie wiesen klinisch keine hochgradigen Störungen des Allgemeinbefindens auf und zeigten sowohl bei der sonographischen als auch bei der patho-histologischen Untersuchung der Leber neben der Fetteinlagerung keine weiteren pathologischen Veränderungen.   Die Methode zur TL und TAG Bestimmung wurde an Lebergewebeproben von 10 Patienten entwickelt. TL wurde gravimetrisch und TAG enzymatisch am Analyseautomaten aus dem TL Extrakt bestimmt. Der mittlere Variationskoeffizient der TL Analyse (N = 10) lag bei 2,2%, der mittlere Intraday-Variationskoeffizient der TAG Bestimmung (N = 10) bei 2,5% und deren mittlerer Interday-Variationskoeffizient bei 3,4%. Die Methode ist genau, kann einfach und rasch durchgeführt werden und ist damit zur Festsetzung des Goldstandards geeignet.   In einer weiterführenden Studie wurden der TL und TAG Gehalt von Lebergewebeproben von 150 Patienten bestimmt. Mit zunehmendem TL Gehalt stieg in den Lebergewebeproben der 150 untersuchten Milchkühe der TAG Gehalt linear an (r² = 0,97). Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass das Verhältnis zwischen TAG und TL mit steigendem TL bis zu einem TL von ca. 100 mg/g FW anstieg und danach ein Plateau bei ca. 70% erreichte. Dieser Zusammenhang konnte mit Hilfe eines linaren Broken-Line Modells genau beschrieben werden. Außerdem konnte mit dem linearen Broken-Line Modell eine Verbesserung der Kalkulation des TAG aus dem TL durchgeführt werden (r² = 0,98). Aufgrund des engen Zusammenhanges zwischen TAG und TL (linear: r² = 0,97; Broken-Line: r² = 0,98) können beide Parameter als Goldstandard für die Leberverfettung verwendet werden.   Das Computerprogramm CAUS (Computer-Aided Ultrasound Diagnosis) zur quantitativen nicht-invasiven Leberfettgehaltsbestimmung wurde an kalibrierten Leberultraschallbildern von 12 Patienten entwickelt. Dafür wurden transkutane und intraoperative, im Zuge der Laparatomie direkt am Organ aufgezeichnete, Leberultraschallbilder verwendet. Als Goldstandard diente TL der Leber. Die Ultraschallbilder wurden mittels CAUS digital korrigiert und bearbeitet. Der quantitative Vergleich der transkutanen und intraoperativen Ultraschallbilder ermöglichte die Erfassung des Bauchwandeinflusses. Die Ultraschallparameter korrelierten sehr gut mit dem TL Gehalt (transkutaner Mean echolevel-TL r = 0,80, transkutane Residual attenuation-TL r = 0,69). CAUS eröffnet damit die Möglichkeit, mittels quantitativer Echotexturanalyse von kalibrierten Brightness-Mode Ultraschallbildern den Leberfettgehalt nicht-invasiv zu bestimmen.   Die diagnostische Genauigkeit von CAUS wurde im Folgenden an transkutanen Leberultraschallbildern von 151 Patienten geprüft. Als Goldstandard diente der biochemisch bestimmte TAG der Leber. Die Ultraschallparameter Mean Echo level (r = 0,59) und Residual attenuation (r = 0,80) korrelierten eng mit TAG, aber auch untereinander eng (r = 0,76). Die 151 Studientiere wurden in ein Trainingsset (N = 76) und in ein Testset (N = 75) unterteilt. Basierend auf den Daten des Trainingssets wurde die Residual attenuation statistisch mittels einer schrittweisen, multiplen Regressionsanalyse für die Berechnung des geschätzten TAG Gehalts ausgewählt (r² = 0,69). Anschließend wurden die geschätzten TAG Gehalte des Testsets genutzt, um Receiver Operating Characteritic Kurven (ROC) zu erstellen. Damit wurden Genauigkeit und diagnostische Sicherheit der Methode zur Differenzierung zwischen verschiedenen gemessenen TAG Gehalten ermittelt. Die Fläche unter der Kurve (AUC-Wert) der ROC Kurven basierend auf den Regressionsformeln war 0,94 (<50 vs. ≥50 mg TAG/g FW), 0,83 (<100 vs. ≥100 mg TAG/g FW) und 0,97 (<50 vs. ≥100 mg TAG/g FW).   Die entwickelte Methode zur nicht-invasiven Bestimmung des Leberfettgehaltes mittels CAUS liefert eine sehr hohe diagnostische Sicherheit bei der Einteilung der untersuchten Tiere in verschiedene Fettgehaltsklassen. Die Automatisierung in der Bildbearbeitung und -analyse sowie die Verwendung nur eines Ultraschallparameters (Residual attenuation) für die Berechnung ermöglichen die Installation des Programms in konventionelle Ultraschallgeräte. Damit ist die Voraussetzung für einen routinemäßigen Einsatz im Rahmen der Bestandsbetreuung erfüllt.

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Haudum, Alois: Echotexturanalyse des Lebergewebes zur nicht-invasiven Bestimmung des Leberfettgehaltes bei Milchkühen. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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