Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung der funktionellen Integrität konservierter Eberspermatozoen in dynamischen Testsystemen

Henning, Heiko

The aim of the study was to test whether methods for assessment of functional integrity in spermatozoa are suitable to detect the impact of storage length on normospermic boar ejaculates. Two experiments were conducted to test (1) the responsiveness of boar sperm to bicarbonate and (2) to test the ability of sperm to undergo volume regulatory processes under different osmotic conditions. In addition, changes in the percentage of chromatin-instable sperm during storage were monitored. In the first experiment three normospermic ejaculates each of 14 boars were diluted in Beltsville Thawing Solution (BTS) and examined after 12, 24, 72, 120, and 168 h of storage. The influx of extracellular calcium into live sperm under capacitating conditions was monitored in a kinetic study using flow cytometry with propidium iodide (PI) and Fluo-3/AM. Although standard semen parameters indicated normospermia, already after 24 h of storage a significant decline in specific response to bicarbonate occurred on the basis of live sperm with low calcium content. During the whole storage period the specific response dropped from 51.8 % (12 h) to 12.4 % (168 h). This suggests that preservation leads to a reduced capability of sperm for capacitation in vitro. The reduced capability could only in part be attributed to bicarbonate-independent destabilization processes. Stimulation of motility by bicarbonate (within 10 min of incubation) was assessed with a CASA-system in a calcium-free variant of Tyrode´s medium with and without 15 mM bicarbonate. Only limited influence of storage length on sperm responsiveness was detected. But implementation of cluster analysis in evaluation of CASA-parameters allowed detection of distinct differences in response of sperm subpopulations to bicarbonate. The ability to show dynamic volume regulatory processes as a sign of functional integrity of the plasma membrane was evaluated in 26 ejaculates (26 boars) after 24 and 72 h of storage using a volume regulation test with iso- and hypotonic conditions. Five parameters characterising volume regulatory processes were combined in a set of criteria to discriminate the ability of boar sperm for volume regulation. After 72 h of storage more samples (23.1 %) contained sperm with markedly reduced ability for volume regulation compared to 24 h of storage (3.8 %). However, the suitability for application of this set of criteria has to be tested on a larger sample base. An increase in the percentage of chromatin-unstable sperm to values higher than 5 % was only detected in three out of 42 ejaculates during storage. In parallel, a marked decrease in the proportion of sperm with intact plasma and acrosomal membranes (PI- and FITC-PNA-negative) was observed for these samples. Therefore, the sperm chromatin structure assay can be rated as rather insensitive for the detection of storage-dependent alterations in liquid preserved boar spermatozoa. In conclusion, dynamic test systems for assessment of functional membrane properties in sperm subpopulations are sensitive tools for the detection of subtle storage-dependent changes in preserved boar sperm.

Das Ziel der vorliegenden Studie war es zu prüfen, in wie weit Methoden zur Bestimmung der funktionellen Integrität der Spermien in der Lage sind, in normospermen Eberejakulaten Einflüsse der Lagerungsdauer bei 17°C darzustellen. In zwei experimentellen Abschnitten wurden Verfahren getestet, die (1) die Ansprechbarkeit von Spermien auf Bikarbonat und (2) die Fähigkeit zur Volumenregulation unter verschiedenen osmotischen Bedingungen erfassten. Darüber hinaus wurde die Veränderung des Anteils chromatinstabiler Spermien während der Lagerung untersucht. Im ersten Abschnitt wurden drei normosperme Ejakulate von 14 Ebern in Beltsville Thawing Solution (BTS) verdünnt und nach 12, 24, 72, 120 und 168 h Lagerungsdauer bei 17°C untersucht. In einer kinetischen Studie wurde die Aufnahme extrazellulären Calciums plasmamembranintakter Spermien (Calciuminflux) unter Kapazitationsbedingungen mit Hilfe der Farbstoffe Propidiumjodid (PI) und Fluo-3/AM durchflusszytometrisch bestimmt. Trotz normospermer Befunde nach standardspermatologischen Kriterien nahm bereits nach 24 h Lagerungsdauer die spezifische Reaktivität auf Bikarbonat berechnet anhand der lebenden Spermien mit niedrigem Calciumionengehalt ab. Sie reduzierte sich über den gesamten Lagerungszeitraum von 51,8 % (12 h) auf 12,4 % (168 h). Konservierte Eberspermien scheinen daher eine verminderte Fähigkeit zur Kapazitation in vitro zu besitzen. Dieser Effekt lässt sich nur für einen Teil der Spermien durch andere, bikarbonatunabhängige Destabilisierungsvorgänge erklären. Kurzfristige (nach 10 min Inkubationsdauer auftretende) spezifische Effekte von Bikarbonat wurden nach einer Stimulation der Motilität in calciumfreien Tyrode-basierten Medien (mit 15 mM und ohne Bikarbonat) mit Hilfe eines CASA-Systems erfasst. Es konnten allerdings nur begrenzt Einflüsse der Lagerungsdauer auf die Reaktion der Spermien dargestellt werden. Die Implementierung einer Clusteranalyse in die Auswertung der CASA-Parameter ermöglichte es, das differente Reaktionsverhalten von Spermiensubpopulation darzustellen. Die Fähigkeit gelagerter Spermien zu einer dynamischen Volumenregulation als Maß für die funktionelle Membranintegrität wurde an 26 Ejakulaten (26 Eber) nach 24 und 72 h Lagerungsdauer in einem Volumenregulationstest unter iso- und hypotonen Bedingungen charakterisiert. Fünf Parameter der Volumenregulation wurden zur Beurteilung der Fähigkeit von Spermien zur Volumenregulation in einem Kriterienkatalog zusammengefasst. Nach 72 h Lagerungsdauer wiesen mehr Proben (23,1 %) Spermien mit deutlich herabgesetzter Fähigkeit zur Volumenregulation auf als nach 24 h Lagerungsdauer (3,8 %). Die Anwendbarkeit des Kriterienkataloges muss allerdings an einer größeren Probenzahl überprüft werden. Während der Lagerung war lediglich in drei von 42 Ejakulaten ein Anstieg des Anteils chromatininstabiler Spermien auf Werte größer 5 % nachweisbar. Parallel war in diesen Ejakulaten eine deutliche Verringerung des Spermienanteils mit intakter Plasma- und Akrosommembran (PI- und FITC-PNA-negativ) zu verzeichnen. Der Spermienchromatinstrukturassay ist daher als wenig sensitiv in der Detektion lagerungsbedingter Veränderungen flüssig konservierter Eberspermien einzustufen. Zusammenfassend konnte in der Arbeit gezeigt werden, dass dynamische Testsysteme zur Erfassung funktioneller Membraneigenschaften in Spermiensubpopulationen sensitive Verfahren zur Erfassung subtiler lagerungsbedingter Veränderungen bei konservierten Eberspermien sind.

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Henning, Heiko: Charakterisierung der funktionellen Integrität konservierter Eberspermatozoen in dynamischen Testsystemen. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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