Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Diagnostik der primären Hämostase beim Hund unter besonderer Berücksichtigung eines neuen Vollblutimpedanzaggregometers

Kalbantner, Kerstin

In the first part of this study, a new impedance aggregation device (Multiplate-Analyser) has been tested for its applicability to dogs. In the second part of this study, this instrument in combination with three other platelet function tests, was used to demonstrate the influence of congenital portosystemic shunt (CPSS) on primary haemostasis in dogs. Initially, blood samples of 20 healthy adult dogs were measured with the new device. As anticoagulant, hirudin was used (as recommended by the manufacturer) and testing time was raised from 6 minutes (recommend for humans) to 12 minutes. To optimise agonist concentrations, a wide range of concentrations was measured in the first 20 dogs (ADP 1–20 µmol/l, collagen 0.5–20 µg/ml, arachidonic acid 0.1–1 mmol/l, ristocetin 0.2, 1 mg/ml and thrombin receptor-activating peptide [TRAP] 32, 160 µmol/l). With the help of ristocetin and TRAP (TRAP-6: Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn) no reliable platelet aggregation could be initiated. Thus, measurements were stopped after 10 dogs and these two agonists were excluded from further tests. After measuring a total number of 50 dogs following ideal agonist concentrations and reference values could be determined for the area under the curve: 10 µmol/l ADP = 1481–3448 AU*min, 5 µg/ml collagen = 2017–3460 AU*min, 1 mmol/l arachidonic acid = 1011–3457 AU*min. Ten additional dogs were sampled to study the influence of different anticoagulants (hirudin, citrate, citrate buffer) on the results. With ADP, collagen and arachidonic acid highest measurement values were achieved with hirudin as anticoagulant (as recommended by the manufacturer), whereas citrate and citrate buffer-anticoagulated blood, regardless of being recalcificated or not, generated distinctly lower values. In conclusion the new whole blood impedance aggregometer is well suited for platelet aggregation measurements in dogs. Providing, hirudin is the preferred anticoagulant. In the second part of this study, the influence of CPSS on primary haemostasis was examined. For this purpose, four common platelet function tests such as capillary bleeding time, platelet function analysis with the platelet function analyser PFA 100, turbidimetric aggregation measurement and impedance aggregation with the Multiplate-device, which was evaluated in the first part of this study. Additionally, a haematological and a biochemical profile of each dog was measured. Ten dogs suffering from CPSS of different breeds (Golden Retriever (n=2), Beagle, Boxer,  Great Dane, English Bulldog, French Bulldog, Pug, Czechechoslovakian Wolfdog and one mongrel) and median age of 5 months (3-9 months) were compared with ten healthy aged-matched control dogs. Capillary bleeding time, platelet function analysis and platelet count did not reveal significant differences between the groups (P > 0.05). Dogs with CPSS had significantly lower AUC values of impedance aggregometry using collagen and arachidonic acid as agonists (e.g. 5 µg/ml collagen: 2948 ± 524 vs. 3472 ± 571 AU*Min; 1 mmol/l arachidonic acid: 1006 ± 522 vs. 1963 ± 738 AU*Min). Surprisingly, turbidimetric aggregation with the highest concentration of collagen (40 µg/ml: 70 ± 20 vs. 50 ± 15 %) showed higher values than in the healthy control dogs. Despite partially deviating aggregation values, results of the global screening tests capillary bleeding time and platelet function analysis did not indicate clinically relevant disorders in primary haemostasis in dogs with CPSS.

Im ersten Teil dieser Studie wurde ein neues Impedanzaggregometer (Multiplate-Analyser) auf seine Eignung zum Einsatz bei Hunden getestet, welches im zweiten Teil der Dissertation zusammen mit drei weiteren Thrombozytenfunktionstests den Einfluss von kongenitalen portosystemischen Shunts (PSS) bei Hunden auf die primäre Hämostase darstellen sollte. Für die ersten Eignungstests des neuen Gerätes wurden zunächst Blutproben von 20 gesunden erwachsenen Hunden gemessen. Als Antikoagulans wurde (wie vom Hersteller empfohlen) Hirudin verwendet und die Testdauer wurde von 6 Minuten (beim Menschen) auf 12 Minuten (beim Hund) erhöht. Um die Agonistenkonzentrationen zu optimieren, wurde bei den ersten 20 Hunden eine große Bandbreite an Konzentrationen gemessen (ADP 1–20 µmol/l, Kollagen 0,5–20 µg/ml, Arachidonsäure 0,1–1 mmol/l, Ristocetin 0,2, 1 mg/ml und Thrombinrezeptor-aktivierendes Peptid [TRAP] 32, 160 µmol/l). Dabei konnte mithilfe von Ristocetin und TRAP (TRAP-6: Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn) keine zuverlässige Thrombozytenaggregation ausgelöst werden, so dass auf diese beiden Agonisten für weitere Versuche verzichtet wurde. Nach Messung von insgesamt 50 Hunden konnten folgende Idealkonzentrationen und Referenzwerte für die Area under the curve ermittelt werden: 10 µmol/l ADP = 1481–3448 AU*min, 5 µg/ml Kollagen = 2017–3460 AU*min, 1 mmol/l Arachidonsäure = 1011–3457 AU*min. Zusätzlich dazu wurden 10 weitere Hunde beprobt, um den Einfluss unterschiedlicher Gerinnungshemmer (Hirudin, Zitrat, Zitratpuffer) auf die Messergebnisse darzustellen. Bei ADP, Kollagen und Arachidonsäure wurden die höchsten Messwerte mit dem vom Hersteller empfohlenen Hirudin als Gerinnungshemmer erreicht, während Zitrat und Zitratpuffer, ganz gleich ob die Proben rekalzifiziert wurden oder nicht, deutlich niedrigere Werte hervorbrachten. Damit erscheint das neue Vollblut-Impedanzaggregometer gut zur Thrombozytenaggregationsmessung bei Hunden geeignet, wobei Hirudinblut dem sonst bei Gerinnungsuntersuchungen üblichen Zitratblut oder mittels Zitratpuffer antikoaguliertem Blut vorzuziehen ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss des PSS auf die primäre Hämostase untersucht. Dazu wurden vier in der Hämostasediagnostik gängige Plättchenfunktionstests angewendet, die kapilläre Blutungszeit, die Plättchenfunktionsanalyse mithilfe eines Plättchenfunktionsanalysegerätes, die turbidimetrische Aggregationsmessung nach Born, sowie die Impedanzaggregometrie mithilfe des im ersten Teil evaluierten Multiplate-Gerätes. Außerdem wurden bei jedem Tier ein Blutbild und ein klinisch-chemisches Organprofil erstellt. Es wurden 10 an PSS erkrankte Hunde unterschiedlicher Rassen (Golden Retriever [n=2], Beagle, Boxer, Deutsche Dogge, Englische Bulldogge, Französische Bulldogge, Mops, Tschechoslowakischer Wolfshund und ein Mischling) und Altersverteilung (Median = 5 Monate, 3–9 Monate) mit 10 gesunden Kontrolltieren der gleichen Alters verglichen. Für die kapilläre Blutungszeit, Plättchenfunktionsanalyse und Plättchenzahl zeigten sich keine deutlichen Gruppenunterschiede (P > 0,05). Bei der Impedanzaggregometrie wurden bei PSS-Hunden, v.a. mit Kollagen und Arachidonsäure deutlich niedrigere Werte gemessen (z.B. bei 5 µg/ml Kollagen: 2948 ± 524 vs. 3472 ± 571 AU*Min; 1 mmol/l Arachidonsäure: 1006 ± 522 vs. 1963 ± 738 AU*Min), während überraschenderweise bei der turbidimetrischen Aggregometrie bei der höchsten  Kollagenkonzentration (40 µg/ml: 70 ± 20 vs. 50 ± 15 %) sogar höhere Werte gemessen wurden als bei den gesunden Kontrollhunden. Trotz dieser teilweise abweichenden Aggregationswerte verdeutlichen die Ergebnisse der globalen Tests kapilläre Blutungszeit und Plättchenfunktionsanalyse, dass bei Hunden mit PSS keine klinisch relevanten Thrombozytenfunktionsstörungen vorliegen.

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Kalbantner, Kerstin: Diagnostik der primären Hämostase beim Hund unter besonderer Berücksichtigung eines neuen Vollblutimpedanzaggregometers. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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