Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Neue diagnostische Verfahren bei neuromuskulären Erkrankungen des Hundes und der Katze

Kiesewetter, Iris Susanne

The pathophysiology of many neuromuscular diseases in dogs and cats is still not understood. 12 European shorthair cats of different age (range: from 2 month to 3 years) were presented with clinical signs of recurrent and progressive spasticity to the University of Veterinary Medicine Hannover, Department of Small Animal Medicine and Surgery. The physical examination revealed a bad body condition and a suppurative rhinitis in all cats. The neurological examination showed exercise and stress induced episodes of muscle spasticity. In between the episodes the cats were neurologically normal. Blood work (n=7), diagnostic imaging including radiographs (n=7) and magnetic resonance imaging (n=4), examination of the cerebrospinal fluid (n=4), electromyography (n=4), a metabolic screening (n=4) and post mortem examinations (n=5) revealed no relevant findings to explain the spasticity. Special clinical tests were performed and a potassium-rich diet led to aggravation of the clinical signs. The owner declined a diagnostic treatment. To make a definitive diagnose a functional examination of ion channels from muscle cells gained from biopsies would have been necessary. Therefore the second part of the study was performed. Skeletal muscle cell culture is an important tool to discover the molecular background of ion channel diseases. The aim of the study was to improve an existing protocol to extract and cultivate canine myoblasts. Using different enzymes for tissue digestion, the contamination of fibrocytes should be reduced and more myoblasts should be gained after a shorter cultivation period. In addition, the influence of the transport time to the laboratory was assessed.  During routine surgery twenty-one muscle biopsies (n = 21) from healthy dogs were taken and divided in two portions of 0.2 g. Samples were mechanically trimmed, enzymatically dissociated using either Protease or Trypsin and cultured under identical conditions for 168 hours. For differentiation of myoblasts and fibroblasts an immunocytochemical staining of the muscle cell specific intermediate filament desmin was performed and the number of both cell types was evaluated. In addition, eight biopsies (n = 8) were used to analyse the influence of shipping time. These samples were cultured on the first, second and third day after surgery. Using Protease as the digesting enzyme a significant higher amount of myoblasts (P = 0.0102) was obtained. After digestion with Protease the average percentage of myoblasts was 78.96% and 54.68% using Trypsin. Furthermore, Protease digestion revealed a better proliferation of cells as assessed by morphological evaluation. The duration of the transport (1 – 3 days) did not show any significant changes (P = 0.798) in the results for the cultured myoblasts. This is the basic requirement to send muscle biopsies of dogs with neuromuscular diseases from clinics to a specialised laboratory. In conclusion, the use of the digestion enzyme Protease is a significant improvement for the cultivation of canine myoblasts. It produces purer cultures and therefore improves the initial conditions for further investigations of myoblasts such as patch clamp techniques or examination of specific muscle proteins.

Die pathophysiologischen Hintergründe vieler neuromuskulärer Erkrankungen des Hundes und der Katze sind noch ungeklärt. In vorliegender Arbeit wurde eine Katzenfamilie vorgestellt, die an Episoden von Myotonie bei erhaltenem Bewusstsein litt. In der Klink für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurde zur Abklärung der spastischen Episoden eine ausführliche Diagnostik durchgeführt. Die klinische Untersuchung zeigte einen schlechten Ernährungszustand und Anzeichen einer eitrigen Rhinits bei allen Katzen. In der neurologischen Untersuchung fielen anstrengungs- und stressinduzierte Episoden von Myotonie auf. Der neurologische Status zwischen diesen Phasen war normal. Blutuntersuchungen (n=7), bildgebende Diagnostik inklusive Röntgen (n=7) und  Magnetresonanztomographie (n=7), die Untersuchung von Liquor (n=4), Elektromyographie (n=4) und eine pathologische Untersuchung (n=5) wiesen auf keine pathologischen Befunde hin, die für die Symptomatik verantwortlich sein könnten. Es wurden aus der Humanmedizin übertragene funktionelle Tests durchgeführt und die Fütterung mit Kalium-angereichertem Futter führte zu einer starken Verschlechterung des klinischen Bildes. Die Diagnose einer Kalium sensitiven Myotonie wurde vermutet. Um eine definitive Diagnose stellen zu können, wäre eine funktionelle Untersuchung der Muskelzellen, die aus Biopsien der Katzen gewonnen wurden, auf molekularer Ebene nötig gewesen.  Ziel der vorliegenden Studie war daher die Optimierung eines klinisch anwendbaren Protokolls zur Erstellung von Muskelzellprimärkulturen: in  entstehenden Mischkulturen aus Myoblasten und Fibrozyten sollte durch Wahl eines anderen Enzyms das Verhältnis zu Gunsten der Muskelzellen verbessert und die Gesamtausbeute bei einem früheren Einsetzen des Zellwachstums gesteigert werden. Zudem sollte die Auswirkung einer Transportdauer der Biopsien zwischen ein und drei Tagen festgestellt werden. Im Rahmen von Routineoperationen wurden 21 Muskelbiopsien (n = 21) entnommen, in zwei Portionen je 0,2 g aufgeteilt und die Muskelstammzellen nach mechanischer Dissoziation enzymatisch entweder mit Protease oder mit Trypsin aufbereitet. Beide Ansätze wurden unter gleichen Kulturbedingungen 168 Stunden inkubiert. Anschließend fand eine immunhistochemische Differenzierung zwischen Myoblasten und Fibrozyten mittels Färbung des Desmins statt und das Verhältnis beider Zellen wurde quantifiziert. 8 Biopsien (n = 8) wurden jeweils am 1., 2. und 3. Tag nach der Entnahme vergleichend mit Protease und Trypsin angelegt und ebenso quantifiziert. Die Auswertung zeigte, dass die Dissoziation mit Protease eine signifikant höhere Ausbeute von Myoblasten und eine somit reinere Kultur erzielt. Mit Protease konnte eine durchschnittliche Myoblastenausbeute von 78,96%, mit Trypsin 54,68% erreicht werden. Anhand mikroskopisch/morphologischer Beurteilung der proliferierenden Zellen konnte gezeigt werden, dass die Entwicklung der mit Protease gewonnenen Myoblasten schneller voranschreitet als die Entwicklung der mit Trypsin gewonnenen Myoblasten.  Somit stellt der Einsatz von Protease anstelle von Trypsin bei der Extrahierung von Myoblasten aus Muskelbiopsien eine Optimierung des bisher angewandten Protokolls dar und erzielt einen höheren Myoblastenanteil in den Primärkulturen, die weiter mit elektrophysiologischen Methoden untersucht werden können. Die Dauer des Transportes zeigt keine signifikante Abweichung der Myoblastenanzahlen innerhalb der ersten drei Tage. Somit ist eine Verschickung von Biopsien über weitere Distanzen möglich.

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Kiesewetter, Iris Susanne: Neue diagnostische Verfahren bei neuromuskulären Erkrankungen des Hundes und der Katze. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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