Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Remodeling im Parodontium des Pferdes

Mensing, Niels

The periodontal ligament (pdl) of the horse is challenged with remodelling itself permanently due to the tooth´s lifelong abrasion, and eruption. Periodontal cells were therefore (1) examined for their proliferation and osteogenic differentiation qualities, and (2) compared with cells from the gingiva and from the subcutis, in order to elaborate on some basic knowledge about their possible suitability for therapeutical purposes. The isolation and selective division of cell populations from pdl (subdivided in three levels), gingiva, and subcutis were the main issues of this study, as well as their comparative examination in vitro. The examinations referred to the following in vitro proliferation parameters: Plating efficiency, Cell number, Proliferation index, Doubling time, Colony forming units. In addition, differentiation assays were performed in vitro; the osteogenic differentiation capacities served as an additional feature to distinguish (between) the above-mentioned cells. An indirect, i.e. Quantitative determination (by means of a photometric assay of the calcium concentration in the medium), and a direct, Qualitative determination (by means of the Von Kossa staining) of the osteogenic differentiation were performed. The following results were obtained: As for the feature groups Doubling time and Colony forming units, pdl cells showed the same values as the gingiva cells. In the feature groups Proliferation index, Cell number as well as Qualitative and Quantitative verification of the osteogenic differentiation, the values were always higher for the pdl cells than for the gingiva cells. Pdl cells always were superior to subcutaneous cells with regard to the features Colony forming units, Proliferation index, and Quantitative calcium determination; the subcutaneous cells, however, had higher values in the feature groups Cell number, Doubling time and Qualitative determination of mineralization products. In the osteogenic differentiation media, the pdl cells produced mineralized extracellular matrix (semiquantitative determination), the amount of which was smaller if compared to subcutaneous cells, but larger if compared to gingiva cells. The following conclusions were derived from these results: The significance of proliferation parameters is relatively low if they are evaluated separately from each other. The combination of analyses of several proliferation parameters is more effective: e.g. the determination of the Doubling time should always precede the determination of the Plating efficiency (i.e. the calculation of the initial cell number). Only the knowledge of the Doubling time allowed the indentifying of the differences between cells in terms of Colony forming units, e.g. subcutis (few large colonies) versus pdl (many small colonies). The tissues of equine pdl, gingiva, and subcutis contain cells which have an osteogenic differentiation potential. This feature – along with other criteria, e.g. Colony forming units – is required in order to classify these cells as mesenchymal stem cells (MCS). However, a further examination of additional MSC typical features (adipogenic and chondrogenic differentiation) is necessary to give evidence to this assumption. With regard to the afore-mentioned findings, a content of presumptive MSC in the equine pdl – higher than in the subcutis – can be assumed, especially in the apical and middle pdl levels. The measurement of the calcium concentrations in the medium facilitates a very early detection of osteogenic differentiation in vitro; this represents a substantial advantage if compared with the direct determination of mineralized extracellular matrix by means of the Von Kossa staining.

Das Ligamentum periodontale (PDL) ist beim Pferd, bedingt durch den lebenslangen Abrieb und Ausschub des Pferdezahnes, einem stetigen Um- und Abbau ausgesetzt. Periodontale Zellen sollten deshalb (1) auf ihre Proliferations- und osteogenen Differenzierungseigenschaften untersucht werden, und (2) hinsichtlich ihrer Qualitäten mit Zellen aus der Gingiva und aus der Subkutis verglichen werden. Somit sollten erste grundlegende Erkenntnisse über ihre mögliche Eignung für therapeutische Zwecke erlangt werden. Im Vordergrund stand die Isolierung und selektive Aufgliederung von Zellpopulationen aus PDL (in drei Ebenen untergliedert), Gingiva und Subkutis sowie die vergleichende Untersuchung in vitro. Bei der Untersuchung wurden folgende In-vitro-Proliferationsparameter zu Grunde gelegt: Anwachsrate, Zellzahl, Proliferationsindex, Generationszeit, Koloniebildungseffizienz. Außerdem wurden Differenzierungsassays in vitro durchgeführt; die osteogene Differenzierungspotenz diente als zusätzliches Merkmal für die Unterscheidung der oben genannten Zellen. Hierbei erfolgte neben einem direkten, qualitativen Nachweis der osteogenen Differenzierung (mittels von Kossa-Färbung) auch ein indirekter, quantitativer Nachweis (mittels photometrischer Bestimmung der Calcium-Konzentration im Medium). Folgende Ergebnisse wurden erzielt: Die PDL-Zellen wiesen in den Merkmalsgruppen Generationszeit und Koloniebildungseffizienz annähernd die gleichen Werte auf wie die Gingiva-Zellen. In den Merkmalsgruppen Proliferationsindex, Zellzahl sowie qualitativer und quantitativer Nachweis der osteogenen Differenzierung wurden bei den PDL-Zellen immer höhere Werte als bei den Gingiva-Zellen ermittelt. PDL-Zellen übertrafen stets Subkutis-Zellen bei den Werten Koloniebildungseffizienz, Proliferationsindex und quantitative Calcium-Bestimmung; in den Merkmalsgruppen Zellzahl, Generationszeit und qualitative Bestimmung von Mineralisierungsprodukten allerdings wiesen die Zellen aus der Subkutis höhere Werte auf. In den osteogenen Differenzierungsmedien bildete die PDL-Zellen mineralisierte extrazelluläre Matrix, deren Menge (semiquantitativ bestimmt) unter der von den Subkutis-Zellen, aber über der von den Gingiva-Zellen lag. Aus diesen Befunden wurde abgeleitet: Die Aussagekraft von nur einzeln untersuchten, isoliert voneinander beurteilten Proliferationsparametern ist relativ gering. Ergiebiger ist die zusammenfassende Betrachtung mehrerer Proliferationsparameter: So sollte z.B. der Generationszeit-Bestimmung immer die Ermittlung der Anwachsrate (also die Berechnung der Ausgangszellzahl) vorangehen. Erst die Kenntnis der Generationszeit machte es möglich, die Unterschiede bei der Koloniebildungseffizienz – Subkutis: wenige große Kolonien, PDL: viele kleine Kolonien – zu deuten. Beim Pferd enthalten sowohl das PDL und die Gingiva als auch die Subkutis jene Zellen, die ein osteogenes Differenzierungspotential besitzen. Es liegt also bei diesen Zellen ein weiteres Kriterium – neben dem Kriterium Koloniebildungseffizienz – vor, das notwenig ist, um diese Zellen als mesenchymale Stammzellen (MSC) zu klassifizieren; es bedarf aber noch der Untersuchung weiterer MSC-typischer Merkmale (adipogene und chondrogene Differenzierung), um dies endgültig abzuklären. Aufgrund dessen darf im equinen Parodontium – speziell in der apikalen und mittleren PDL-Ebene – ein höherer Gehalt an MSC vermutet werden als in der Subkutis. Die Messung der Calcium-Konzentration im Medium erlaubt sehr früh einen Rückschluss auf eine osteogene Differenzierung in vitro; dies bietet einen entscheidenden Vorteil gegenüber dem direkten Nachweis mineralisierter extrazellulärer Matrix mittels von Kossa-Färbung.

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Mensing, Niels: Remodeling im Parodontium des Pferdes. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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