Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Application of horse genomics to identify quantitative trait loci (QTL) for chronic pastern dermatitis in German draft horses

Mittmann, Evelyn Henrike

The objective of the first part of this thesis was to establish a highly polymorphic minimal screening set of microsatellite markers for horses (MSSH) that is annotated on the horse genome assembly EquCab2.0. This MSSH covers all autosomes and the X chromosome with 322 evenly spaced microsatellites whose positions were determined on the horse genome assembly (EquCab2.0). The average chromosomal distance among markers amounts to 7.44 Mb. The characteristics established for this microsatellite set were the number of alleles, the observed heterozygosity (HET), and the polymorphism information content (PIC) for Hanoverian warmblood (HW) and several German coldblood horse breeds (CB). The average number of alleles was 7.3 and 8.0 in HW and CB, respectively. HET was at 71% for HW and CB, PIC at 65% (HW) and 67% (CB). This MSSH allows scanning of the whole horse genome at close to 7-10 Mb resolution. Furthermore, we identified a total of 21 781 equine microsatellites on the second horse genome assembly which can be found at http://www.tiho-hannover.de/einricht/zucht/mol_gen/ms_horse/horse_ms.htm. These microsatellites cover the horse genome with a mean distance of 112 kb. Most of the repeat motifs (72 %) were dinucleotide repeats of AC, GT and AT with frequencies of 26.4%, 26.0% and 19.4%. We identified adjacent SINE and LINE elements and the corresponding gene ID for 5549 (25.5%) intragenic microsatellites. Primer pairs were designed for 12 246 microsatellites after masking repetitive elements. The effort of developing a suitable markerset was made because the main objective of this thesis was to perform a whole genome scan for chronic pastern dermatitis in draft horses. Chronic pastern dermatitis (CPD), also known as chronic progressive lymphedema (CPL), is a skin disease that affects draft horses. This disease causes painful lower leg swelling, nodule formation and skin ulceration interfering with movement. The aim of this whole genome scan was to identify quantitative trait loci (QTL) for CPD in German draft horses. Out of 917 German draft horses, 31 paternal half-sib families with 378 horses from the breeds Rhenish German, Schleswig, Saxon-Thuringian and South German were chosen for genotyping. Genotyping was done for 318 polymorphic microsatellites that were evenly distributed on all equine autosomes and the X chromosome with a mean distance of 7.44 Mb. An across-breed multipoint linkage analysis revealed chromosome-wide significant QTL on horse chromosomes (ECA) 1, 9, 16 and 17. Analyses by breed confirmed the QTL on ECA1 in South German and the QTL on ECA 9, 16 and 17 in Saxon-Thuringian draft horses. For the Rhenish German and Schleswig draft horses, further QTL on ECA4 and 10 and for the South German draft horses an additional QTL on ECA7 were found. This is the first whole genome scan for CPD in draft horses and it is an important step towards the identification of candidate genes.

Aussagekräftige Kopplungsstudien können mit Merkmalen wie Mauke durchgeführt werden, die auf extremen Phänotypen oder auf vielen betroffenen Individuen beruhen, wenn entsprechend polymorphe Mikrosatelliten Marker zur Verfügung stehen. Der erste Schritt zur erfolgreichen Durchführung einer Kopplungsstudie für Mauke beim Deutschen Kaltblut war daher die Entwicklung eines hoch polymorphen Markersets, welches anhand der zweiten Pferdegenomsequenz (EquCab2.0) angeordnet wurde. Die 322 Mikrosatelliten des Markersets (MSSH) sind gleichmäßig auf allen Pferde Autosomen und dem X-Chromosom verteilt. Der durchschnittliche chromosomale Abstand zwischen Markern betrug 7,44 Mb, die durchschnittliche Anzahl der Allele bei den Hannoveranern war 7,3 und bei den Deutschen Kaltblütern 8,0. Die Heterozygotie war in beiden Pferderassen gleich hoch mit HET 71%, Polymorphie Informationsgehalt (PIC) lag bei den Hannoveranern bei 65% und bei den Kaltblütern bei 67%. Mit diesem minimalen Markerset können Genomscans in unterschiedlichsten Pferderassen mit einer genomweiten Abdeckung von 7-10 Mb durchgeführt werden. Ein bioinformatischer Ansatz für die Suche nach neuen Mikrosatelliten wurde mit permutierten repetitiven Sequenzmustern aller möglichen zweier bis fünfer Basenkombinationen mit 15-30 Wiederholungen durchgeführt. Dies hat mit 19.541 neuen Mikrosatelliten zu einem 400%igen Anstieg von auf der 2. Pferdegenomsequenz angeordneten Markern geführt. Die neu identifizierten Mikrosatelliten sind im durchschnittlichen Abstand von 112 Kilobasen (kb) über das gesamte Pferdegenom verteilt. Die meisten der repetitiven Sequenzmuster mit 72% waren Muster mit zwei Basen, Dinukleotide; AC (26,4%), GT (26,0%) und AT (19,4%). Der Positionsabgleich mit bekannten Genen ergab, dass 25,5% der neuen Marker in einem intragenischen Bereich lagen. Nach der Maskierung repetitiver Sequenzbereiche konnten für insgesamt 12.246 Mikrosatelliten Primer designed werden. Es wurde die Gesamtdatei mit allen anderen Ergebnissen auf http://www.tiho-hannover.de/einricht/zucht/mol_gen/ms_horse/horse_ms.htm zugänglich gemacht. Im Fokus dieser Doktorarbeit stand die genetische Prädisposition für Mauke, die für die unterschiedlichen Deutschen Kaltblutpferderassen auf 20% bis zu 90% geschätzt wurde. Mauke ist eine entzündliche, im Fesselbereich beginnende und in chronischen Fällen bis zu den Karpal- und Tarsalgelenken ziehende Hauterkrankung. Schon im 17. Jahrhundert wurde Mauke als eine sich kontinuierlich verschlimmernde, chronische Erkrankung bei Kaltblütern beschrieben. Trotz zahlreicher neuer Therapieansätze wurde seit dieser Zeit für die Behandlung der Mauke kein wirksamer Ansatz gefunden. Die palliative Behandlung ist mühsam und langwierig und nur selten kann eine dauerhafte Linderung der Symptomatik erzielt werden. Aus den Blutproben von 917 Kaltblütern wurden 378 Pferde aus den Zuchtverbänden des Rheinisch Deutschen Kaltbluts, des Schleswiger Kaltbluts, des Sächsisch-Thüringischen Kaltbluts und des Süddeutschen Kaltbluts ausgewählt. Die Maukeprävalenz im Familienmaterial des Genomscans war bei den einzelnen Kaltblutrassen unterschiedlich, wobei die Süddeutschen mit 70,6%, die Sächsisch-Thüringischen mit 82,3%, die Schleswiger mit 84,1% und die Rheinisch-Deutschen sogar mit 90,9% von Mauke betroffen waren. Für den Genomscan wurden insgesamt 318 Mikrosatelliten typisiert. Der durchschnittliche Abstand zwischen den Markern war 7,5 ± 8,2 Mb groß, die durchschnittliche Anzahl Allele betrug 7,1, die Mittelwerte von HET lagen bei 65,7% und von PIC bei 63,8%. Es ergab sich eine signifikante Kopplung für das Auftreten der chronischen Mauke zu insgesamt 4 Chromosomregionen auf ECA1, 9, 16 und 17. Die Kopplungsanalysen innerhalb der einzelnen Rassen konnten alle Merkmalsgenorte (QTL) bestätigen, der QTL auf Chromosom 1 war besonders für das Süddeutsche Kaltblut genomweit signifikant, und die QTL auf Chromosom 9, 16 und 17 zeigten signifikante LOD Scores beim Sächsisch-Thüringischen Kaltblut. Zusätzlich konnten noch chromosomweit signifikante QTL für die Süddeutschen Kaltblüter auf Chromosom 7, und für die Schleswiger auf Chromosom 10 und 11 nachgewiesen werden. Diese Kopplungsstudie ist die erste genomweite Untersuchung an von chronischer Mauke betroffenen Kaltblütern. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Entwicklung von Mauke von mehreren Genen beeinflusst wird. Diese QTL ermöglichen eine Suche nach neuen positionellen Kandidatengenen.

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Mittmann, Evelyn Henrike: Application of horse genomics to identify quantitative trait loci (QTL) for chronic pastern dermatitis in German draft horses. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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