Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Development of a new mouse model to study long term actions of estradiol and genistein in the heart: roles of estrogen receptor subtypes

Nguyen, Ba Tiep

The aims of this study were: (1)           to establish a new mouse model to investigate cardiac effects of estrogenic compounds in vivo in the healthy heart; (2)           to use the model for evaluating dose-dependent effects of GEN in the heart; and (3)           to decipher the role of each estrogen receptor subtype in mediating cardiac effects of estrogenic compounds in vivo. For the first aim, in experiment 1, ovariectomized (ovx) mice were treated with estradiol (E2) or genistein (GEN) containing diet for three months. The treatment dose of 4.32 mg of E2/kg diet equivalent to 0.015 mg E2/animal/day resulted in physiological serum levels of E2. Treatment with E2 prevented the ovariectomy-induced loss of heart weight; increased cardiomyocyte sizes (CMS) and altered expression of about thousand genes in the left ventricle as evaluated by chip microarray assay. GEN at the dose of 1 g/kg diet (equivalent to 2.93 mg/animal/day) did not affect uterus and heart weights but increased CMS and altered expression of several genes which are also regulated by E2 in the heart. This data are the first evidences of effects of E2 and GEN in the healthy heart. The treatment protocol proved to be valid to study long term effects of estrogenic substances in the heart. The results form experiment 2 confirmed that this new model is valid to evaluate dose-dependent effects of GEN in the heart. GEN at the dose of 1 g/kg diet or higher exerted effects on cardiac gene expression. High doses of GEN (10 g and 3 g/kg diet equivalent to 28.2 and 8.58 mg/animal/day, respectively) caused uterus and heart hypertrophy. It is concluded that in mice, the dose of 1 g GEN/kg diet is the “effective safe dose” regarding the heart. In ovx estrogen receptor alpha knockout (αERKO) mice used for experiment 3, E2 lost the preventive effects against the decrease of heart mass due to ovariectomy. The effects of E2 on expression of cardiac genes like IGF1, Acta2 and Myocd were also lost.  In estrogen receptor beta knockout (βERKO) mice (experiment 4), most of cardiac effects of E2 were maintained. Effects of E2 on heart mass are similar to the effects on body and uterus weights in wild type and βERKO mice. Effects of GEN on expression of IGF1, Acta2 and Myocd were lost in αERKO mice while in βERKO mice only IGF1 expression was altered by GEN. It is concluded that ERα is a key mediator for cardiac effects of E2. Though GEN affects heart mass and cardiac gene expression, a role of each estrogen receptor subtype in mediating the action of GEN in the in vivo heart cannot be explained unequivocally at present. Taken together, this is the first report on cardiac effects of E2 and GEN under physiological conditions and deciphering the role of each estrogen receptor subtype in mediating cardiac effects of estrogenic compounds in vivo. Whether the reported effects of E2 and GEN in the heart are due to direct actions on cardiomyocytes are not clear at present. Therefore, the molecular actions of E2 and GEN in the healthy heart may be further characterized by in vitro studies using cardiomyocytes.

Die vorliegende Studie verfolgte 3 Ziele: (1)               Entwicklung eines neuen Mausmodells zur In-vivo-Untersuchung von Effekten von Östrogen wirkenden Substanzen im gesunden Herzen, (2)               Anwendung dieses Modells zum Studium von dosisabhängigen Effekten von Genistein im Herz und (3)               Untersuchung der Rolle von Östrogenrezeptor-Subtypen für die Vermittlung von kardialen Effekten von östrogen wirkenden Komponenten in vivo. Im ersten Experiment wurden ovariektomierte Mäuse mit einer Genistein- oder östradiol haltigen Diät für 3 Monate ernährt. Die eingesetzte Dosis von 4,32 mg Östradiol/kg Futter (equivalent zu 0,015 mg/Tier/Tag) erzeugte physiologische Spiegel des Steroides im Serum. Die Behandlung mit Östradiol verhinderte die durch Ovariektomie induzierte Abnahme des relativen Herzgewichtes, erhöhte die Größe der Kardiomyozyten und veränderte in der Mikroarray-Analyse die Expression von etwa 1000 Genen im linken Ventrikel. Die Dosis von 1 g Genistein/kg Diät (equivalent zu 2,93 mg Genistein/Tier/Tag) hatte keinen Einfluss auf das Herzgewicht, steigerte aber die Größe der Kardiomyozyten und veränderte die Expression einiger Gene, die ebenfalls durch Östradiol reguliert werden. Diese Ergebnisse zeigen erstmals Effekte von Östradiol und Genistein im gesunden Herzen. Das Behandlungsprotokoll hat sich als geeignet herausgestellt, um Langzeiteffekte von östrogenartig wirkenden Substanzen im Herz zu untersuchen. Die Befunde des Experimentes 2 bestätigen, dass dieses neue Mausmodell geeignet ist, um dosisabhängige Effekte von östrogen wirkenden Substanzen (hier am Beispiel des Genisteins) im Herz zu untersuchen. Dosierungen von 1 g Genistein/kg Futter oder höher veränderten die kardiale Genexpression. Die höchsten Dosen von Genistein (10 oder 3 g Genistein/kg Futter) verursachten eine Uterus- und Herzhypertrophie. Es kann geschlussfolgert werden, dass die Dosis von 1 g Genistein/kg Futter die „sichere effektive Dosis“ bezüglich eines Effektes im Herz von Mäusen ist. In ovariektomierten Östrogenrezeptor-alpha knockout-Mäusen, die im Experiment 3 verwendet wurden, zeigte Östradiol keinen präventiven Effekt mehr gegen die Ovariektomie induzierte Abnahme des Herzgewichtes. Ebenso waren keine Effekte von Östradiol auf die kardiale Expression von IGF-I, Acta-II und Myocd festzustellen. In Östrogenrezeptor-beta knockout-Mäusen (Experiment 4) blieben die meisten der kardialen Effekte von Östradiol im Vergleich zu Wildtyp-Tieren erhalten. Der Effekt von Östradiol auf das Körper- und Uterusgewicht entsprach in ER-β knockout-Mäusen demjenigen, der in Wildtyp-Tieren beobachtet wurde. Die Effekte von Genistein auf die Expression von IGF-I, Acta-II und Myocd blieben im ER-α knockout-Mäusen vollständig aus, während in den ER-β knockout-Mäusen lediglich die IGF-I Expression durch Genistein verändert wurde. Es ist daher zu folgern, dass ER-α der wesentliche Mediator für die kardialen Effekte von Östradiol im Herz ist. Obwohl Genistein das Herzgewicht und die kardiale Genexpression beeinflusst, kann aus den vorliegenden Daten nicht eindeutig geschlossen werden, welcher Rezeptorsubtyp für die kardialen Effekte des Phytoöstrogens verantwortlich ist. Zusammenfassend ist dies der erste Bericht über kardiale Effekte von Östradiol und Genistein unter physiologischen Bedingungen und zur Untersuchung der Bedeutung der Östrogenrezeptorsubtypen bei der Vermittlung von kardialen Effekten von östrogenen Substanzen in vivo. Ob die beobachteten Effekte von Östradiol und Genistein im Herz auf eine direkte Wirkung dieser Substanzen auf die Kardiomyozyten zurückzuführen ist, ist im Augenblick unklar. Daher sollten die molekularen Mechanismen der kardialen Effekte von E2 und Genistein in Kulturen von Kardiomyozyten untersucht werden.

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Nguyen, Ba Tiep: Development of a new mouse model to study long term actions of estradiol and genistein in the heart: roles of estrogen receptor subtypes. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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