Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss einer gestaffelten CLA-Supplementation auf die Gelbkörperfunktion während des Zyklus und der frühen Gravidität bei Hochleistungsmilchkühen

Onnen-Lübben, Eike Friedrich

The aim of this study was to analyse the effect of a graded supplementation of conjugated linoleic acids (CLA) on corpus luteum function of high yielding dairy cows during estrus cycle and early pregnancy. An ultrasound-guided transvaginal technique for corpus luteum biopsy was developed and validated on slaughterhouse ovaries and later on 4 dairy cows. For the main experiment 40 HF dairy cows were randomly divided into 3 groups considering milk yield of former lactation, body weight and lactation number. The control group (n=15) received a normal ration concentrate whereas the daily ration of group 1 (n=14) was supplemented with 50 g CLA per cow and 100 g of CLA was added to the daily ration for the animals of group 2 (n=11). All three groups were synchronized by Ov-synch-procedure and inseminated 16-18 hours after the last application of GnRH. To evaluate the influence of a graded CLA-supplementation on corpus luteum function during oestrous and early pregnancy, luteal biopsies were taken at different time points (Day 6, Day 13, Day 20) by transvaginal ultrasound-guided biopsy-method. Pregnancy was diagnosed via ultrasonography at day 32. If pregnant, a fourth corpus luteum biopsy was taken at day 45. Prior to each biopsy, the size and the blood flow area of the corpus luteum was analysed and recored by Doppler sonography. Blood samples were taken from A/V. sacralis media prior to each biopsy, each manual examination and each medication. Afterwards progesterone and IGF-I- levels were determined. The following results were obtained: 1.) Procedures for retrieving a corpus luteum biopsy in cattle by a transvaginal ultrasound-guided method allow several biopsies from a single corpus luteum with no detectable alteration in subsequent function. All cows with biopsies showed similar progesterone levels as control animals. The biopsy procedure showed reproducible results in weight and size of the biopsies. 2.) A significant increase of corpus luteum size from day 6 to day 13 p.i. during estrus cyle could be observed in cows of all three groups (p<0,05).There were no significant differences regarding C.l.-size inbetween the cows of the three feeding groups. Significant differences of corpus luteum size were observed on day 20 p.i. between pregnant and non-pregnant cows of all 3 groups (p<0,05). Blood flow area and C.l.-size showed a significant positive correlation to each other from day 6 to day 45 p.i. in animals of group 1 (r=0,97; p=0,027) and of the control group (r=0,98; p=0,011)  Additionally the animals of group 1 had the largest corpus luteum size on day 45 p.i.. Their C.l.-size differed significantly from the size of the corpus luteum of the animals belonging to the control group (p=0,048) and from the animals belonging to group 2 (p=0,043). However, there were no significant differences on day 45 p.i. concerning the C.l.-size of animals belonging to group 2 and that of animals belonging to the control group. 3.) The area of luteal blood flow increased significantly from day 6 to day 13 p.i. in the animals of all 3 groups during oestrus cycle (p<0,05). However, no significant difference could be found inbetween the animals of the three groups during oestrus cycle. A significant increase in luteal blood flow area from day 6 to day 13 p.i. was detected in the 3 groups of all pregnant cows (p<0,05). Furthermore a tendency and positive correlation between blood flow area and progesterone level from day 6 to day 45 was observed in group 1 (r=0,91; p=0,083) and group 2 (r=0,94; p=0,05). At day 20 p.i. the area of corpus luteum blood flow differed significantly between pregnant and non-pregnant cows (p<0,05). However, a comparison between all pregnant cows from day 6 to day 45 p.i. showed no significant differnces in blood flow area. 4.) A significant increase of progesterone level was observed from day 6 to day 13 p.i. in the animals of the 3 feeding groups during estrous cycle (p<0,05). However, a comparison between the animals of the 3 groups showed no significant difference related to the progesterone level. Only the pregnant cows belonging to group 2 showed a significant increase from day 6 to day 13 p.i (p<0,05). On day 20 p.i. P4-value of pregnant cows differed significantly from that of non-pregnant cows (p<0,05). Futhermore a positive correlation between progesterone level and corpus luteum size was detected for animals of group 1 (r=0, 94; p=0,059) and of the animals of group 2 (r=0,98; p=0,002) from day 6 to day 45 post artificial insemination. Comparisons between the 3 feeding groups of pregnant cows from artificial insemination to day 45 p.i. showed a tendency difference between the animals of groups 1 and control group (p=0,076) respectively a significant difference to the animals of group 2 (p=0,025). However, there was no difference between the animals of the control group and the animals of group 2 on this day of examination. 5.) Significant increases of luteal cells/mm² were noticed from day 6 to day 13 p.i. in the animals of all feeding groups during estrous cylcle (p<0,05). Only the pregnant cows of group 2 showed a significant increase of luteal cells/mm² from day 6 to day 13 p.i. Also significant differences between pregnant cows and non-pregnant cows were observed on day 20 p.i. (p<0,05). Futhermore positive correlations between luteal cells/mm² and corpus luteum size differed tendencely or significantly for the animals of control group on day 6 p.i. (r=0,91; p=0,085), for the animals of group 1 on day 13 p.i. (r=0,99; p=0,005) and for the animals of group 2 on day 6 (r=0,91; p=0,085) and from day 6 to day 45 p.i. (r=0,98; p=0,02). 6.) IGF-I-concentrations for the animals of group 2 differed significantly from animals of control group (p<0,05) and from the animals of group 1 (p<0,05) during estrous cycle. On day 20 p.i there were no significant differences between pregnant and non pregnant cows as in the other cases. A positive correlation between IGF-I and progesterone-level was observed from day of insemination to day 45 p.i. in the animals of group 2 in tendency (r=0,76; p=0,076). Comparing the 3 feeding groups of pregnant cows, group 2 and group 1 differed significantly from controls from day of insemination to day 45 p.i. (p<0,05). No significant differences were observed between the animals of group 1 and group 2. The results of this study indicate that a graded supplementation with conjugated linoleic acids (c9, t11; t10, c12) had almost no effect on corpus luteum sizes, luteal blood flow areas, luteal cells/mm² and progesterone levels from the cows during estrus cycle and early pregnancy. However, significant differences in IGF-I-concentration between the animals of the feeding groups supplemented with CLA and the animals of the control group indicate a dose-dependant effect in estrus cycle and a group-dependant effect during early pregnancy. The results also indicated that repeated transvaginal ultrasound-guided biopsy of the corpus luteum in cattle is a practical procedure without altering its function. Tissue integrity was sufficiently preserved in the biopt to study the amounts of large luteal cells. In futher studies it could be a goal to analyze the luteal tissue by RT-PCR to explore the complexity of bovine corpus luteum.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkungen einer Fütterung mit Supplementation konjugierter Linolsäuren (CLA) auf die Corpus luteum-Funktion von Hochleistungskühen während des Zyklus und der frühen Trächtigkeit zu untersuchen. In einem Vorversuch wurde die Methode der transvaginalen ultraschallgeleiteten Corpus luteum-Biopsie zunächst an Ovarien geschlachteter Rinder und danach an 4 Kühen getestet und etabliert. Für den Hauptversuch standen 40 Kühe der Rasse Holstein-Friesian zur Verfügung, die unter Berücksichtigung der Milchleistung in der Vorlaktation, der Lebendmasse und der Laktationsnummern zufällig in 3 Gruppen aufgeteilt wurden. Die Kontrollgruppe (n=15) erhielt eine normale Kraftfutterration zum Grundfutter, während das Milchleistungsfutter der Gruppe 1 (n=14) mit 50 g CLA/Tier/Tag und das der Gruppe 2 (n=11) mit 100 g CLA/Tier/Tag supplementiert wurde. Nach einem Standard-Ov-Synchprotokoll erfolgte die Besamung der Tiere 16-18 Stunden nach der letzten GnRH-Applikation. Um den Einfluss der CLA-Fütterung auf die Gelbkörperfunktion während des Zyklus und der frühen Gravidität zu untersuchen, wurden mit Hilfe der transvaginalen ultraschallgeleiteten Corpus luteum-Biopsie an Tag 6, Tag 13 und Tag 20 nach der K.B. luteale Gewebeproben vom C.l. der Kühe entnommen. An Tag 45 p.i. erfolgte eine erneute Gelbkörper-Biopsie bei den Tieren, die zuvor an Tag 32 durch eine Ultraschalluntersuchung für tragend erklärt worden waren. Vor jeder transvaginalen Corpus luteum-Biopsie wurde der Gelbkörper in seiner maximalen Größe im B-Mode ultrasonographisch dokumentiert und anschließend die maximale Durchblutung im größten möglichen Durchmesser dopplersonographisch im Color-Angio-Modus dargestellt und analysiert. Zur Bestimmung des Gehaltes an Progesteron und IGF-I im Blutplasma erfolgte eine Blutentnahme bei den Kühen vor jeder Biopsie, jeder manuellen Untersuchung und medikamentellen Applikationen aus der A./V. sacralis mediana. Es konnten folgende Ergebnisse erarbeitet werden: 1) Die Vorversuche zur Etablierung der transvaginalen Corpus luteum-Biopsie zeigten, dass die Methode keinen Einfluss auf den Zyklus der Kühe hatte. Die Progesteronwerte im Plasma der Tiere aus der Biopsiegruppe unterschieden sich nicht signifikant zur den Tieren aus der Kontrollgruppe. Ebenso konnten reproduzierbare Ergebnisse bei Biopsiegewicht- und größe ermittelt werden. 2.) Im Hauptversuch wurde kein Einfluss der CLA-Fütterung auf die Gelbkörpergesamtfläche während des Zyklus bemerkt. Es konnte ein signifikanter Unterschied in der C.l.-Gesamtfläche an Tag 20 p.i. zwischen den graviden und nicht tragenden Tieren gesehen werden (p<0,05). Außerdem bestand eine signifikant positive Korrelation zwischen der durchbluteten Lutealfläche und der Gesamtgelbkörperfläche über den zeitlichen Verlauf von Tag 6 bis Tag 45 p.i. bei den Tieren der Gruppe 1 (r=0,97; p=0,027) und den Tieren der Kontrollgruppe (r=0,98; p=0,011). An Tag 45 zeigten die Tiere der Gruppe 1 die größte Lutealfläche, die sich signifikant von den Tieren der Kontrollgruppe (p=0,048) und von denen der Gruppe 2 (p=0,043) unterschied. Jedoch war kein signifikanter Unterschied zwischen den Tieren der Gruppe 2 und den Tieren der Kontrollgruppe zu ermitteln. 3.) Während des Zyklus war kein Einfluss der CLA-Fütterung auf die luteale Randdurchblutung sichtbar. Weiterhin korrelierten die durchblutete Lutealfläche und der P4-Wert signifikant positiv über den zeitlichen Verlauf von Tag 6 bis Tag 45 p.i. bei den Tieren der Gruppe 1 (r=0,91; p=0,083) und Gruppe 2 (r=0,94; P=0,050). An Tag 20 p.i. ließ sich ein signifikanter Unterschied in Bezug auf die mittlere luteale Durchblutungsfläche zwischen den tragenden und nicht graviden Tieren feststellen (p<0,05). Die mittlere durchblutete Lutealfläche der Kühe aus den 3 Fütterungsgruppen unterschied sich nicht signifikant untereinander von Tag 6 bis Tag 45 p.i.. 4.) Während des Zyklus ließ sich kein Effekt der CLA-Fütterung auf den Progesteronwert bei den Tieren der 3 Gruppen ermitteln.. An Tag 20 p.i. wiesen die tragenden Tiere einen signifikant höheren P4-Wert auf als die nicht trächtigen Tiere. Gleichzeitig zeigte sich eine signifikant positive Korrelation zwischen dem P4-Wert und der C.l.-Gesamtfläche bei den Tieren der Gruppe 1 (r=0,94; p=0,059) und bei den Tieren der Gruppe 2 (r=0,98; p=0,002) über den zeitlichen Verlauf von Tag 6 bis Tag 45 nach der Besamung. Die Tiere der Gruppe 1 wiesen an Tag 45 p.i. die höchste P4-Konzentration auf und unterschieden sich tendenziell zu den Tieren der Kontrollgruppe (p=0,076) und zu den Tieren der Gruppe 2 (p=0,025). Die Tiere der Gruppe 2 und der Kontrollgruppe unterschieden sich nicht signifikant an diesem Untersuchungstag. 5.) Während des Zyklus konnte kein Einfluss der CLA-Fütterung auf die Anzahl der großen Lutealzellen festgestellt werden. An Tag 20 p.i. wiesen die tragenden Tiere signifikant mehr große Lutealzellen/mm² auf als die nicht tragenden Tiere (p<0,05). Die Anzahl großer Lutealzellen/mm² korrelierte tendenziell bzw. signifikant positiv mit der C.l.-Gesamtfläche bei den Tieren der Kontrollgruppe an Tag 6 (r= 0,91; p=0,085),  bei den Tieren der Gruppe 1 an Tag 13 (r=0,99; p=0,005) und bei den Tieren der Gruppe 2 an Tag 6 (r=0,84; p=0,073) sowie über den zeitlichen Verlauf von Tag 6 bis Tag 45 p.i. (r=0,98; p=0,02). Die Anzahl der großen Lutealzellen/mm² unterschied sich nicht signifikant von Tag 6 bis Tag 45 p.i. zwischen den Tieren der 3 Fütterungsgruppen untereinander 6.) Während des Zyklus wiesen die Tiere der Gruppe 2 die höchste IGF-I-Konzentration auf und unterschieden sich signifikant von den Tieren der Gruppe 1 und denen der Kontrollgruppe (p<0,05). Ein signifikanter Unterschied an Tag 20 p.i. zwischen tragenden Tieren und nicht graviden Tieren, konnte wie bei den oben genannten Messgrößen, nicht ermittelt werden. Der IGF-I-Wert korrelierte tendenziell positiv mit dem P4-Wert über den zeitlichen Verlauf von Tag 6 bis Tag 45 p.i. bei den Tieren der Gruppe 2 (r=0,76; p=0,076). Die trächtigen Tiere der Gruppe 2 und Gruppe1 unterschieden sich durch ihre hohen IGF-I-Werte signifikant von der Kontrollgruppe vom Zeitpunkt der K.B. bis Tag 45 p.i. (p<0,05). Die Resultate der vorliegenden Studie weisen darauf hin, dass eine Supplementierung des Kraftfutters durch CLA mit den Isomeren c9, t11 und t10, c12  keinen signifikanten Effekt auf die Corpus luteum-Gesamtfläche und dessen durchbluteten Anteil, sowie auf die Anzahl der großen Lutealzellen/mm² und deren Progesteronproduktion während des Zyklus und der frühen Trächtigkeit hat. Jedoch weisen die signifikanten Unterschiede in der IGF-I-Konzentration innerhalb des Zyklus auf eine Dosisabhängigkeit und während der frühen Gravidität auf einen Gruppeneffekt bei der Fütterung hin. Die transvaginale ultraschallgeleitete Corpus luteum-Biopsie bietet die Möglichkeit, luteale Gewebeproben vom Gelbkörper zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Zyklus und während der frühen Trächtigkeit zu gewinnen, ohne die Funktion des Gelbkörpers zu beeinflussen. Die lutealen Gewebeproben eigneten sich für nachfolgende histologische Untersuchungen zur Bestimmung der großen Lutealzellen. In weiterführenden Studien könnte das luteale Gewebe, das mit Hilfe der transvaginalen Corpus luteum-Biopsie gewonnen wurde, auf molekularer Ebene mittels RT-PCR untersucht werden, um die Komplexizität des bovinen Corpus luteums besser verstehen zu können.

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Onnen-Lübben, Eike Friedrich: Einfluss einer gestaffelten CLA-Supplementation auf die Gelbkörperfunktion während des Zyklus und der frühen Gravidität bei Hochleistungsmilchkühen. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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