Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Vergleich in vitro produzierter Embryonen hinsichtlich ihrer Qualität nach dem Kryokonservieren durch Vitrifikation oder konventionelle Kryokonservierung

Stinshoff, Hanna

The quality of in vitro produced embryos is still poorer than that of their in vivo produced counterparts. There are various reasons for this. The aim of the present study was to evaluate the influence of different cryopreservation methods on the quality of in vitro produced bovine embryos. For this 738 bovine blastocysts were produced in a standard IVP-system using SOF(aa) media. Of these 738 embryos 131 blastocysts were cryopreserevd conventionally using 1.5M ethylene glycol and a programmable freezer  and 106 were vitrified using a commercially available vitrification kit. Post thawing embryos were cultured for another 48 h and reexpansion and hatching rates were assessed. Of the 131 coventionally cryopreserved embryos 104 (79.4%) reexpanded and 80 (61.1%) hatched. 86 (81.1%) of 106 vitrified embryos reexpanded and 67 (63.2%) hatched. Hatched blastocysts were furthermore used for cell staining and Rt-qPCR. In cell staining the total cell number of previously vitrified (121.3 ± 21.2), previously conventionally cryopreserved (117.6 ± 20.4) and of a control group which had not been cryopreserved (130.2 ± 25.6) were assessed. Additionally the live-dead-ratio of cells was obtained (vitrified: 17.2, cryoconserved conventionally: 15.3, control group: 17.9) No significant differences could be found here. The Rt-qPCR was used to assess the relative abundance of eight developmentally important genes (HSP70-1, SLC2A1, SLC2A3, DSC2, CDH1, TJP1, DNMT3A, IFNt). Significant differences could be found in 4 of 8 gene transcripts when comparing vitrified embryos with embryos of the control group and in 6 of 8 gene transcripts when comparing slow frozen embryos with embryos of the control group.

Die Qualität in vitro produzierter Embryonen ist immer noch deutlich schlechter als die ihrer in vivo generierten Gegenstücke. Hierfür gibt es unterschiedliche Gründe. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es den Einfluss unterschiedlicher Kryokonservierungsverfahren auf die Qualität in vitro produzierter boviner Embryonen zu ermitteln. Hierfür wurden in einem Standard-IVP-System 738 bovine Blastozysten erzeugt. Von diesen wurden 131 in einem kommerziell erhältlichen Einfriergerät konventionell kryokonserviert (mittels 1,5 M Ethylenglycol). Weitere 106 Blastozysten wurden mittels eines kommerziell erhältlichen Vitrifikationskits kryokonserviert. Nach dem Auftauen wurden Reexpansions- und Schlupfraten ermittelt. Von den 131 konventionell krokonservierten Embryonen reexpandierten 104 (79,4%) und 80 (61,1%) schlüpften. Von den vitrifizierten Embryonen reexpandierten 86 (81,1%) und 67 (63,2%) schlüpften. Die geschlüpften Embryonen beider Gruppen wurden weiter in einer Differentialfärbung und in der Rt-qPCR eingesetzt. In der Differentialfärbung wurden die Gesamtzellzahlen der zuvor vitrifizierten (121.3 ± 21.2), der konventionell kryokonservierten (117.6 ± 20.4) und die einer Kontrollgruppe (130.2 ± 25.6) ermittelt. Zusätzlich wurde eine Lebend-Tot-Ratio ermittelt (Vitrifiziert: 17,2; konventionell krokonserviert: 15,3; Kontrollgruppe: 17,9). Bei diesen Untersuchungen konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen gefunden werden. Die Rt-qPCR wurde genutzt, um die Expression acht entwicklungsrelevanter Gentranskripte (HSP70-1, SLC2A1, SLC2A3, DSC2, CDH1, TJP1, DNMT3A, IFNt) zu ermitteln. Beim Vergleich der vitrifizierten Embryonen mit denen der Kontrollgruppe konnten in der Expression von vier von acht Gentranskripten signifikante Unterschiede festgestellt werden. Signifikante Unterschiede in sechs von acht Gentranskripte waren beim Vergleich der Gruppe der konventionell kryokonservierten Embryonen mit denen der Kontrollgruppe festzustellen.

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Stinshoff, Hanna: Vergleich in vitro produzierter Embryonen hinsichtlich ihrer Qualität nach dem Kryokonservieren durch Vitrifikation oder konventionelle Kryokonservierung. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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