Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zu 3g-Nanotechnologien als Basis für ein gezieltes Drug-Delivery-System am Modell des Meerschweinchen-Innenohres

Wolf, Melanie

The aim of this study was to develop multifunctional nanoparticles as nonviral vectors into the inner ear which are biodegradable, traceable in vivo and can be attached to a variety of therapeutic agents combined with a targeted drug-delivery and controlled drug release to a selective cell population in the cochlea. The first step in developing a novel drug-delivery system included the examination of the basic structures of Hyperbranched Polylysine and Lipid Nanocapsules concerning biocompatibility, traceability in the tissue and the capability to infiltrate different cells.   In an initial in-vitro-study, these types of nanoparticles were cultivated with L929-fibroblasts and visualized in these cells via confocal laser scanning microscopy (CLSM). Furthermore the cellular uptake was quantitatively determined by fluorescence measurements whereas vitality tests with neutral red gave information about the cytotoxic properties of these particles. Hyperbranched Polylysine as well as Lipid Nanocapsules penetrated the cultured cells accumulating in the cytoplasm near the nucleus without entering it. Dilutions of the stock solution between 1:10 and 1:100 caused a significant reduction of cell vitality but higher dilution did not result in significant differences to the control group incubated without nanoparticles.   Based upon these results the nanoparticle dilution applied in vivo was chosen to be above 1:100, in order to reduce the risk of toxic effects to the inner ear. Two groups each of 18 guinea pigs were treated either with Hyperbranched Polylysine or Lipid Nanocapsules via cochleostomy of the left scala tympani. The contralateral ears served as control and were operated and treated with PBS. Using electrophysiological measurements of the acoustically-evoked auditory brainstem response (AABR), functional effects of nanoparticle-injection on hearing thresholds were determined. CLSM was used to examine cellular infiltration and nanoparticle-traceability in the inner ear tissue. Cytocochleograms documented possible toxic effects on hair cells. Both types of nanoparticles were detected in all cochlear cell types from basal to apical penetrating the cell membranes but not the nuclear membranes. AABR data analysis resulted in significantly increased hearing thresholds after two days in the high frequencies for both vectors but without statistically significant differences to the PBS-treated control ears. After 14 and 28 days the hearing thresholds decreased again to values that were not significantly different compared to day 0. Additionally, the cytocochleograms did not detect any hair cell loss so that the reversible increase of hearing threshold is probably due to the operation procedure and not due to toxic effects of Hyperbranched Polylysine or Lipid Nanocapsules.   Hyperbranched Polylysine and Lipid Nanocapsules distribution in the whole cochlea, their ability to penetrate cells without causing morphological or functional toxic effects and their traceability in living tissue via fluorescence labelling comply with the basic requirements for a novel drug-delivery-system.   Further research concerning nanoparticle-uptake mechanisms and surface modifications of the basic structures will follow to change unspecific distribution into a targeted selective drug-delivery to specific cell types. After that, suitable agents (genes or neurotrophic factors) can be chosen to cause a biological effect at the target location. Examinations concerning pharmacokinetics and pharmacodynamics will be added to develop a secure drug-delivery-system using nanoparticles as nonviral vectors and innovative therapeutic strategy for inner ear diseases.

Ziel dieser Studie ist es, multifunktionale Nanopartikel als nonvirale Vektoren ins Innenohr zu entwickeln, die biodegradierbar und in vivo nachweisbar sind, mit einer Vielzahl therapeutischer Wirkstoffe beladen werden können und diese präzise zu ausgewählten Zellpopulationen in der Cochlea transportieren und zeitlich kontrolliert freisetzen. Einen ersten Schritt zur Entwicklung eines solchen Drug-Delivery-Systems stellt die Untersuchung der Grundstruktur von Hyperverzweigten Polylysinen (HP) und Lipidnanokapseln (LNK) auf Biokompatibilität, Verfolgbarkeit im Gewebe und Infiltrationsvermögen dar.   Dazu wurden diese Nanopartikeltypen in einer ersten In-vitro-Studie mit L929-Mausfibroblasten kultiviert und anschließend mittels Konfokaler Lasermikroskopie in den Zellen visualisiert. Quantitativ konnte die Nanopartikelaufnahme in die Zellen über Fluoreszenzmessungen ermittelt werden, während ein Vitalitätstest mit Neutralrot Aufschluss über zytotoxische Eigenschaften der Partikel gab. Sowohl Hyperverzweigte Polylysine als auch Lipidnanokapseln penetrierten dabei alle Zellen der Kultur, wobei sie in Kernnähe im Zytoplasma akkumulierten, ohne den Nucleus zu infiltrieren. Verdünnungen der Stammlösung von 1:10 bis 1:100 führten dabei zu einer Reduktion der Zellvitalität, die erst ab einer 1:300-Verdünnung keinen signifikanten Unterschied zur nanopartikelfreien Kontrollgruppe mehr aufwies.   Basierend auf diesen In-vitro-Daten wurde anschließend die in vivo zu applizierende Nanopartikelmenge so gewählt, dass keine toxischen Effekte im Innenohr zu erwarten waren. Per Cochleostomie erhielten 18 Meerschweinchen Hyperverzweigte Polylysine und dieselbe Tierzahl Lipidnanokapseln in die linke Scala tympani appliziert, während die jeweilige Gegenseite derselben Tiere zur Kontrolle mit PBS behandelt wurde. Über elektrophysiologische AABR-Messungen wurden die funktionellen Auswirkungen der Nanopartikelinjektion auf die Hörschwellen der Tiere dokumentiert. Mit Hilfe der Konfokalmikroskopie wurden die Verfolgbarkeit und das Infiltrationsvermögen im Innenohrgewebe untersucht, während die Aufstellung von Zytocochleogrammen der histologischen Darstellung möglicher toxischer Effekte auf die Haarzellen diente. Beide Nanopartikel konnten in allen Zelltypen des Innenohres von basal bis apikal nachgewiesen werden, wobei sie die Zellmembran, nicht aber die Kernmembran penetriert hatten. Die Auswertung der AABR-Daten ergab zwar einen signifikanten Anstieg der Hörschwellen nach zwei Tagen bei den hohen Frequenzen für beide Vektorentypen, allerdings konnte kein Unterschied zur PBS-behandelten Kontrollseite nachgewiesen werden. Nach 14 bzw. 28 Tagen sank dieser Hörschwellenanstieg wieder auf nicht signifikant erhöhte Werte bezogen auf Tag 0. Die Analyse der Zytocochleogramme ergab keinen Haarzellverlust, so dass der reversible Hörschwellenanstieg vermutlich auf die Operationsmethode und nicht auf toxische Eigenschaften der Hyperverzweigten Polylysine oder Lipidnanokapseln zurückzuführen war.   Die Verteilung der Nanopartikel in der gesamten Cochlea, ihre Fähigkeit, alle Zelltypen zu penetrieren, ohne zu morphologischen oder funktionellen toxischen Erscheinungen zu führen und ihre Verfolgbarkeit im Gewebe über Fluoreszenzmarkierung sind wesentliche Grundanforderungen, die an ein neuartiges Drug-Delivery-System gestellt werden und von Hyperverzweigten Polylysinen und Lipidnanokapseln gleichermaßen erfüllt werden.   Weitere Studien zum Aufnahmemechanismus der Nanopartikel in die Zellen und möglichen Oberflächenmodifikationen der Grundstruktur werden folgen, um die bislang unspezifische Verteilung in einen zielsicheren selektiven Wirkstofftransport zu spezifischen Zelltypen zu wandeln. Erst dann kann eine Wahl geeigneter Substanzen (z. B. Gene oder neurotrophe Faktoren) erfolgen, um auch einen biologischen Effekt am Wirkort zu erzielen. Studien zur Pharmakokinetik und Pharmakodynamik werden sich anschließen, so dass ein anwendungssicheres Drug-Delivery-System entwickelt werden kann, bei dem nonvirale Vektoren in Form von Nanopartikeln als innovative therapeutische Strategie für Innenohrkrankheiten genutzt werden.

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Wolf, Melanie: Untersuchungen zu 3g-Nanotechnologien als Basis für ein gezieltes Drug-Delivery-System am Modell des Meerschweinchen-Innenohres. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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