Methods of investigating drug-induced increase in the expression of the drug efflux transporter P-glycoprotein in different cell types

Epilepsie ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen und betrifft Menschen und Tiere, wie zum Beispiel Hunde und Katzen. Die medikamentöse Behandlung ist die am häufigsten gewählte Therapieform. Allerdings reagieren ungefähr ein Drittel der Patienten nicht in ausreichendem Maße auf die verschiedenen, eingesetzten Antiepileptika. Die Mechanismen für diese Pharmakoresistenz sind weit gehend unbekannt. Es gibt aber zwei Hypothesen, welche die Gründe für Pharmakoresistenz zu erklären versuchen: die so genannte Transporter-Hypothese und die Target-Hypothese (Schmidt und Löscher, 2009). Entsprechend der ersten verringern Multidrug-Transporterproteine in der Blut-Hirn-Schranke die Aufnahme von Substanzen in das Gehirngewebe und führen so zu einer geringen Substanzkonzentration, die keine ausreichende Wirkung ermöglicht. Tishler et al. (Tishler et al., 1995) erbrachten Hinweise für eine Verbindung zwischen der Überexpression von Multidrug-Transportern und Pharmakoresistenz, indem sie im epileptischen Hirngewebe eine Hochregulation von P-Glycoprotein (Pgp) zeigten, eines der am besten untersuchten Multidrug-Transporterproteine. Die Target-Hypothese handelt von strukturellen und/oder funktionellen Veränderungen an den Zielstrukturen der Antiepileptika im epileptischen Gewebe. Diese veränderten Zielstrukturen bewirken dann einen verminderten Effekt der Substanzen (Löscher und Potschka, 2005a). Beispielsweise haben Studien gezeigt, dass strukturelle und funktionelle Veränderungen der inhibitorischen GABA(A) Rezeptoren an der Resistenz gegenüber Substanzen zur Epilepsiebehandlung beteiligt sein können (Bethmann et al., 2008). Die hier beschriebene Arbeit konzentrierte sich auf die Transporter-Hypothese, und besonders auf Pgp, als ein möglicher Hauptgrund für Pharmakoresistenz bei Epilepsie. Um die Pharmakoresistenz zu überwinden, ist es notwendig die Mechanismen aufzuklären, die ihr zugrunde liegen. Daher wurde in dieser Arbeit untersucht, ob häufig eingesetzte Antiepileptika eine Überexpression von Multidrug-Transportern hervorrufen und so eine verringerte Substanzkonzentration im Gehirn bewirken. Zu diesem Zweck wurden zwei Zelllinien verwendet: MDCK, eine epitheliale Nierenzelllinie, und GPNT, eine Endothelzelllinie aus dem Gehirn der Ratte. Diese Zellen wurden vor allem deswegen benutzt, weil sie als Modell für die Blut-Hirn-Schranke gelten. MDCK Zellen haben den Vorteil, dass sie bereits in Untersuchungen zum Substanztransport eingesetzt wurden, GPNT Zellen dagegen exprimieren einige endotheliale Markerproteine. Für beide Zelllinien sind die Kulturbedingungen bereits bekannt. Zunächst mussten die Protokolle für die verwendeten Methoden zur Untersuchung von Proteinexpression und –funktion, Western Blot und Uptake Assay, etabliert werden. Die Zellen wurden mit Antiepileptika über bestimmte Zeit behandelt und anschließend wurden Expression und Funktionalität untersucht. In MDCK Zellen wurde Pgp durch den spezifischen Antikörper als doppelte Banden nachgewiesen mit Signalen bei Molekulargewichten von 140 und 160 kDa. Es lässt sich vermuten, dass beide Signale Pgp darstellen, allerdings in unterschiedlich glykosylierter Form. Es konnte gezeigt werden, dass die Bande bei 140 kDa das kern-glykosylierte Pgp darstellt, während die bei 160 kDa das voll-glykosylierte, reife Protein repräsentiert. Da in der vorliegenden Arbeit die funktionstüchtige Form von Pgp untersucht werden sollte, wurde für die Auswertungen die Bande bei 160 kDa herangezogen. Im Gegensatz zu MDCK konnte bei GPNT Zellen nur eine Bande bei 160 kDa nachgewiesen werden. Die einzelnen Experimente mit MDCK und GPNT Zellen variierten in den Ergebnissen. Diese Beobachtung könnte in den Besonderheiten der beiden Zelllinien begründet sein. Zum Beispiel kommt es zu Veränderungen in der Pgp-Expression während der Kultivierung. Die Expression scheint dabei von der Anzahl der Passagen der jeweiligen Zellen abzuhängen. Darüber hinaus dürften Dauer und Beginn der Behandlung mit Antiepileptika im Hinblick auf die Differenzierung der Zellen von Relevanz sein. Im Allgemeinen ergab sich durch Behandlung von MDCK Zellen mit Antiepileptika keine Beeinflussung der Pgp-Expression. Auch in GPNT Zellen wurden Expression und Funktion unter Behandlung nicht verändert. Hier konnte allerdings funktionelles Pgp nachgewiesen werden. So zeigte sich im Uptake Assay nach Zugabe des Pgp-Inhibitors Tariquidar eine signifikant erhöhte Aufnahme von Pgp-Substraten in die GPNT Zellen. Nach Behandlung mit Antiepileptika dagegen wurde keine veränderte Pgp-Funktion im Transport von zwei Pgp-Substraten, Digoxin und Vinblastin, beobachtet. Insgesamt konnten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit keine robusten Effekte auf Pgp-Expression und -Funktion nach Behandlung mit Antiepileptika zeigen. Allerdings könnte es sein, dass sich die hier gewählten Zelllinien, GPNT und MDCK, nicht als Modelle für diese Untersuchungen eignen, entweder aufgrund eines hohen endogenen Pgp-Spiegels oder wegen hoher Expression anderer Multidrug-Transporter. Daher wären weitere Experimente mit anderen Zelllinien notwendig, um die Transporter-Hypothese noch besser zu untersuchen und möglicherweise geeignetere Modelle für Pgp-Expressionstudien  zu finden.