Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Implication of lipid microdomains in regulation of protein trafficking and epithelial cell morphology

Hein, Sina Zeynep

The discovery of the lipid microdomains has provided a new insight to our understanding of cellular membranes and introduced us to a whole new dimension full of answers that can elicit many cellular processes from signalling to protein sorting and infection. The retrieval of these answers requires isolation and biochemical analyses of these microdomains and their components. To date, a variety of non-ionic detergents like Triton X-100, Lubrol WX, and Tween-20 have been successfully used to isolate such microdomains from in biological samples. Growing number of studies employing model proteins and several detergents in different cellular systems have conveyed a great deal of information about the functional characteristics of lipid microdomains. Nevertheless, further information is necessary to produce concrete explanations for the scope of the functions of lipid microdomains in vivo. This study has aimed to elucidate the implications of lipid microdomains in epithelial cells, especially in early protein sorting events and cell differentiation. Employing detergent insolubility as a discrimination method in Madin Darby Canine Kidney (MDCK) cells, it was revealed that GPI-anchor acts as a sorting determinant for a protein’s inclusion into Tween-20 resistant microdomains (Tween-20-DRMs). This interaction between the GPI-anchored protein membrane dipeptidase (MDP) and DRMs was found to be responsible for the rapid and efficient exit of MDP from the endoplasmic reticulum (ER). The removal of the GPI-anchor resulted in the exclusion of MDP from DRMs and an accumulation in the ER. The rate of Golgi to cell surface transport was similar for wild type and anchorless mutant and this has led to the conclusion that ER-exit was the bottleneck in the anterograde transport of MDP and possibly for other DRM-associated proteins. These finding support the theory that proteins are selectively packed in different carriers in the ER and lipid microdomains in the ER membranes contribute to the diversity of these specialized carriers and assure further transport of competent proteins. Such diversity is also present among trans-Golgi network (TGN)-derived vesicles. Detergent insolubility is a determinant for a subgroup of such vesicles that exploit actin based cytoskeletal tracts to reach apical cell membrane. Annexin II is a component of this vesicle species and it has been shown to be essential for the arrival of the contents of these carriers at the apical membrane. Annexin II is a lipid binding protein, which has been shown to interact with lipids from membrane microdomains (cholesterol, PI(4,5)P2). It also can bind F-actin at membrane sites rich in cholesterol and sphingolipids and thereby participate dynamic membrane events such as vesicle fusion and fission. The mechanism how annexin II modulates membrane microdomains and its contribution to processes involving DRMs were investigated in intestinal cell model Caco-2. This was accomplished by stable downregulation of annexin II by RNAi. Caco-2-A4 clone was found to express only 10-15% of normal annexin II levels in wild type cells. Analyses revealed a decrease in expression of several intestinal hydrolases (sucrase isomaltase, angiotensin converting enzyme 2) and microvillus associated protein ezrin as well. Clone Caco-2-A4 also failed to display an increasing pattern of apical hydrolase levels with time. Morphological examination of ultrastructural features of the cells has supported these findings by reduced number and length of microvilli in Caco-2-A4. Additional to the impaired apical transport of brush border enzymes, it was discovered that apical distribution of cytokeratin 19 (K19) was severely disrupted in Caco-2-A4. This could be explained by the appearance of a non-phosphorylated pool of K19, which probably results in depolymerization and subsequent displacement of K19 from the apical cytoskeleton in the clone A4. I suggest that regulation of K19 by annexin II is one of the initial events taking place in cell differentiation. Annexin II is responsible for the apical localization of K19 and this supports the apical cytoskeletal scaffold on which the microvilli are formed.

Die Entdeckung von Lipid-Mikrodomänen hat zu einem tieferen Verständnis der Zellmembranen beigetragen und gewährt Einblick in eine völlig neue Dimension möglicher Erklärungen einer Vielzahl zellulärer Prozesse, von der Signalgebung über den Proteintransport bis hin zu Infektionen. Zur Beantwortung dieser Fragen bedarf es der Isolierung und biochemischen Analyse dieser Mikrodomänen und ihrer Komponenten. Bis heute wurden verschiedene nicht-ionische Detergenzen wie Triton X-100, Lubrol WX, und Tween-20 erfolgreich zur Isolierung solcher Mikrodomänen aus biologischen Proben eingesetzt. Anhand zahlreicher Studien, bei denen Modellproteine und unterschiedliche Detergenzen in verschiedenen Zellsystemen eingesetzt wurden, konnten viele Informationen über die funktionellen Charakteristika von Lipid-Mikrodomänen gewonnen werden. Dennoch sind weitere Informationen erforderlich, um die Funktionen von Lipid-Mikrodomänen im lebenden Organismus vollständig aufzuklären. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Wirkungsweise von Lipid-Mikrodomänen in Epithelzellen aufgeklärt werden, besonders in der frühen Phase des Proteintransports und der Zelldifferenzierung. Durch den Einsatz der Detergenzunlösichkeit als Diskriminierungsmethode in Madin Darby Canine Kidney (MDCK) Zellen konnte gezeigt werden, dass ein GPI-Anker wie ein „sorting determinant“ bei der Aufnahme eines Proteins in Tween-20 resistente Mikrodomänen (Tween-20-DRMs) fungiert. Die Wechselwirkung zwischen (der) GPI-verankerter „Proteinmembrandipeptidase“ (MDP) und DRMs ist verantwortlich für den schnellen und effizienten Austritt von MDP aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER). Das Entfernen des GPI-Ankers hat zu einem Ausschluss von MDP aus den DRMs, sowie zu einer Anhäufung im ER geführt. Da die Transportrate vom Golgi zur Plasmamebran für den Wildtyp und die „ankerlose“ Mutante gleich/ähnlich war, kann man daraus schlussfolgern, dass der Austritt aus dem ER als „bottleneck“ im anterograden Transport von MDP und möglicherweise auch anderen DRM-assozierten Proteinen fungiert. Diese Erkenntnisse unterstützen die Theorie, dass Proteine selektiv in unterschiedliche Vesikel des ER gebündelt werden und die Lipid-Mikrodomänen in den ER-Membranen zur Vielfältigkeit dieser spezialisierten Vesikel beitragen und einen weiteren Transport von Proteinkomponenten sichern. Eine derartige Vielfalt liegt auch bei Vesikeln des trans-Golgi-Netzwerk(TGN) vor. Die Detergenzunlöslichkeit ist eine Eigenschaft, die bestimmte Vesikelpopulationen nutzen um entlang des Aktin-Zytoskeletts zur apikalen Zellmembran zu gelangen. Annexin II ist eine Komponente dieser Vesikelspezies von der gezeigt werden konnte, dass sie essenziell ist für den Transport solcher „Carrier“ zur apikalen Membran.  Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass Annexin II ein lipidbindendes Protein ist, das mit Lipiden der Membranmikrodomänen (cholesterol, PI(4,5)P2) interagiert. Außerdem kann es F-Aktin an cholesterol- und sphingolipidreiche Membranbereiche binden und dadurch an dynamischen Membranprozessen wie Vesikelfusion und -trennung teilnehmen. Der Mechanismus der Modulation von Membranmikrodomänen durch Annexin II und sein Beitrag zu Prozessen, die DRMs einbeziehen wurden im intestinalen Zellmodell Caco-2 untersucht. Dies wurde durch eine stabile Herabregulation von Annexin II mittels RNAi erreicht. Der Caco-2-A4-Klon exprimiert nur 10-15 % des normalen Annexin II Gehalts von Wildtypzellen. Expressionsanalysen haben gezeigt, dass im Vergleich zum Wildtyp eine Abnahme der Expression einiger intestinaler Hydrolasen (Saccharase Isomaltase, Angiotensin konvertierendes Enzym-2), sowie des Mikrovilli-assozierten Proteins Ezrin zu erkennen ist. Darüberhinaus konnte auch keine Expressionszunahme nach längerer Kultivierung der Zellen festgestellt werden. Eine morphologische Untersuchung der Ultrastruktur dieser Zellen hat diese Ergebnisse dadurch bestätigt, dass die Anzahl und die Länge der Mikrovilli in Caco-2-A4 reduziert waren. Zusätzlich zum verminderten apikalen Transport von Bürstensaumenzymen wurde entdeckt, dass die apikale Verteilung von Zytokeratin 19 (K19) in Caco-2-A4 stark gestört war. Dies könnte durch das Auftreten eines nicht-phosphorylierten Reservoirs von K19 im Klon A4 erklärt werden, welches in der Depolymerisierung des Aktin Zytoskeletts mit anschließender Entfernung von K19 von diesem resultiert.  Ich behaupte, dass die Regulierung von K19 durch Annexin II einer der initialisierenden Schritte ist, die während der Zelldifferenzierung ablaufen. Annexin II ist für die apikale Lokalisation von K19 verantwortlich, wodurch das apikale Zytoskelett unterstützt wird, welches am Aufbau und der Erhaltung der Mikrovilli beteiligt ist.

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Hein, Sina Zeynep: Implication of lipid microdomains in regulation of protein trafficking and epithelial cell morphology. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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