Implication of lipid microdomains in regulation of protein trafficking and epithelial cell morphology

Die Entdeckung von Lipid-Mikrodomänen hat zu einem tieferen Verständnis der Zellmembranen beigetragen und gewährt Einblick in eine völlig neue Dimension möglicher Erklärungen einer Vielzahl zellulärer Prozesse, von der Signalgebung über den Proteintransport bis hin zu Infektionen. Zur Beantwortung dieser Fragen bedarf es der Isolierung und biochemischen Analyse dieser Mikrodomänen und ihrer Komponenten. Bis heute wurden verschiedene nicht-ionische Detergenzen wie Triton X-100, Lubrol WX, und Tween-20 erfolgreich zur Isolierung solcher Mikrodomänen aus biologischen Proben eingesetzt. Anhand zahlreicher Studien, bei denen Modellproteine und unterschiedliche Detergenzen in verschiedenen Zellsystemen eingesetzt wurden, konnten viele Informationen über die funktionellen Charakteristika von Lipid-Mikrodomänen gewonnen werden. Dennoch sind weitere Informationen erforderlich, um die Funktionen von Lipid-Mikrodomänen im lebenden Organismus vollständig aufzuklären. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Wirkungsweise von Lipid-Mikrodomänen in Epithelzellen aufgeklärt werden, besonders in der frühen Phase des Proteintransports und der Zelldifferenzierung. Durch den Einsatz der Detergenzunlösichkeit als Diskriminierungsmethode in Madin Darby Canine Kidney (MDCK) Zellen konnte gezeigt werden, dass ein GPI-Anker wie ein „sorting determinant“ bei der Aufnahme eines Proteins in Tween-20 resistente Mikrodomänen (Tween-20-DRMs) fungiert. Die Wechselwirkung zwischen (der) GPI-verankerter „Proteinmembrandipeptidase“ (MDP) und DRMs ist verantwortlich für den schnellen und effizienten Austritt von MDP aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER). Das Entfernen des GPI-Ankers hat zu einem Ausschluss von MDP aus den DRMs, sowie zu einer Anhäufung im ER geführt. Da die Transportrate vom Golgi zur Plasmamebran für den Wildtyp und die „ankerlose“ Mutante gleich/ähnlich war, kann man daraus schlussfolgern, dass der Austritt aus dem ER als „bottleneck“ im anterograden Transport von MDP und möglicherweise auch anderen DRM-assozierten Proteinen fungiert. Diese Erkenntnisse unterstützen die Theorie, dass Proteine selektiv in unterschiedliche Vesikel des ER gebündelt werden und die Lipid-Mikrodomänen in den ER-Membranen zur Vielfältigkeit dieser spezialisierten Vesikel beitragen und einen weiteren Transport von Proteinkomponenten sichern. Eine derartige Vielfalt liegt auch bei Vesikeln des trans-Golgi-Netzwerk(TGN) vor. Die Detergenzunlöslichkeit ist eine Eigenschaft, die bestimmte Vesikelpopulationen nutzen um entlang des Aktin-Zytoskeletts zur apikalen Zellmembran zu gelangen. Annexin II ist eine Komponente dieser Vesikelspezies von der gezeigt werden konnte, dass sie essenziell ist für den Transport solcher „Carrier“ zur apikalen Membran.  Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass Annexin II ein lipidbindendes Protein ist, das mit Lipiden der Membranmikrodomänen (cholesterol, PI(4,5)P2) interagiert. Außerdem kann es F-Aktin an cholesterol- und sphingolipidreiche Membranbereiche binden und dadurch an dynamischen Membranprozessen wie Vesikelfusion und -trennung teilnehmen. Der Mechanismus der Modulation von Membranmikrodomänen durch Annexin II und sein Beitrag zu Prozessen, die DRMs einbeziehen wurden im intestinalen Zellmodell Caco-2 untersucht. Dies wurde durch eine stabile Herabregulation von Annexin II mittels RNAi erreicht. Der Caco-2-A4-Klon exprimiert nur 10-15 % des normalen Annexin II Gehalts von Wildtypzellen. Expressionsanalysen haben gezeigt, dass im Vergleich zum Wildtyp eine Abnahme der Expression einiger intestinaler Hydrolasen (Saccharase Isomaltase, Angiotensin konvertierendes Enzym-2), sowie des Mikrovilli-assozierten Proteins Ezrin zu erkennen ist. Darüberhinaus konnte auch keine Expressionszunahme nach längerer Kultivierung der Zellen festgestellt werden. Eine morphologische Untersuchung der Ultrastruktur dieser Zellen hat diese Ergebnisse dadurch bestätigt, dass die Anzahl und die Länge der Mikrovilli in Caco-2-A4 reduziert waren. Zusätzlich zum verminderten apikalen Transport von Bürstensaumenzymen wurde entdeckt, dass die apikale Verteilung von Zytokeratin 19 (K19) in Caco-2-A4 stark gestört war. Dies könnte durch das Auftreten eines nicht-phosphorylierten Reservoirs von K19 im Klon A4 erklärt werden, welches in der Depolymerisierung des Aktin Zytoskeletts mit anschließender Entfernung von K19 von diesem resultiert.  Ich behaupte, dass die Regulierung von K19 durch Annexin II einer der initialisierenden Schritte ist, die während der Zelldifferenzierung ablaufen. Annexin II ist für die apikale Lokalisation von K19 verantwortlich, wodurch das apikale Zytoskelett unterstützt wird, welches am Aufbau und der Erhaltung der Mikrovilli beteiligt ist.