Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Studies on pathogenesis of avian Metapneumovirus (aMPV) infection in turkeys and the role of immune mechanisms for the protection against aMPV

Rubbenstroth, Dennis

The avian Metapneumovirus (aMPV) is an economically important pathogen of tur-keys, which causes an acute respiratory disease called turkey rhinotracheitis (TRT). Little information is available on the immune mechanisms involved in protection against aMPV. In particular, the role of specific T-lymphocytes is still largely unclear. To address the questions regarding the role of humoral and cell-mediated immune mechanisms in the control of aMPV-infection in turkeys, we conducted two studies as parts of this thesis. In the first part the protective effect of antibodies against aMPV was investigated (Chapter 4). Turkeys were passively immunized by intravenous injection of aMPV-specific antibodies. Subsequently, they were challenged with a virulent aMPV subtype A (aMPV-A) strain. Antibody transfer resulted in high virus neutralizing (VN) and IgG-ELISA antibody titres in sera and in respiratory secretions, such as tracheal washings and lacrimal fluid. Following aMPV challenge-infection of turkeys with and without aMPV-specific antibodies no differences in clinical disease, histopathological respiratory lesions and aMPV-detection were detected between the groups. This data con-firms that antibodies do not provide protection against aMPV-infection in naïve turkeys. For the investigation of the role of T-lymphocytes in primary aMPV-infection (Chapter 5) and in vaccine-induced protection (Chapter 6) turkeys were chemically T-lymphocyte suppressed by treatment with the immunosuppressive drug Cyclosporin A (CsA). The CsA-mediated T-lymphocyte suppression was confirmed in vitro using a flowcytometric proliferation assay with carboxy fluorescein succimidyl ester (CFSE). Concentrations of 0.25 to 1 µg/ml CsA completely abrogated mitogen-induced proliferation of turkey T-lymphocytes in vitro. Turkeys were treated by intramuscular injection of 100 mg/kg CsA every three to four days. Absolute numbers of CD4 and CD8a positive T-lymphocytes in peripheral blood of CsA-treated turkeys were significantly decreased by up to 80%, as compared to untreated turkeys (P<0.05). This confirmed the T-lymphocyte-suppressive effect of CsA in vivo. To elucidate the role of T-cells in the control of primary aMPV-infection (Chapter 5) CsA-treated and untreated turkeys were inoculated with virulent aMPV-A in two consecutive experiments. In both experiments CsA-mediated depletion of T-lymphocytes resulted in prolonged persistence of the virus. This was accompanied by a delayed recovery from clinical signs by about two days. CsA-treated groups also had significantly higher number of birds with histopathological lesions still detectable in trachea and nasal turbinates two weeks after inoculation. These results demonstrate that T-lymphocytes play an important role in the clearance of primary aMPV-infection in turkeys. This is in agreement with data collected on other Pneumovirinae infections in mammals. To investigate the role of vaccine-induced T-cell immunity in the protection against aMPV-infection, three vaccination experiments have been conducted (Chapter 6). CsA-treated and untreated turkeys were inoculated with a live aMPV-A vaccine and subsequently challenged with virulent aMPV-A. Replication of the vaccine, development of clinical signs and antibody response in vaccinated birds varied considerably between the three experiments. Untreated vaccinated turkeys developed protection against challenge infection in all three experiments. In two experiments also the CsA-treated turkeys were protected. Good replication of the vaccine had been detected in these groups. In the third experiment, in which the vaccine was barely detected by RT-PCR, CsA-treated turkeys were fully susceptible to challenge infection and developed clinical disease. The results show, that suppression of T-lymphocytes may impair protection against aMPV-infection. However, CsA-treatment may not be an optimal model for investigation of T-cell mediated protection in turkeys. We speculated that the CsA-mediated T-cell suppression may be compensated in the case of sufficient immune stimulation. aMPV has been shown to predispose turkeys to secondary pathogens due to the induction of epithelial lesions. Riemerella anatipestifer (RA) is frequently found in turkey flocks in Germany. The development of RA-induced disease is possibly related to the presence of exacerbating factors, such as aMPV. A further part of this project therefore focussed on the role of aMPV in the pathogenesis RA-infection in turkeys (Chapter 7). A RA-infection model for the inoculation via different respiratory routes was established. Respiratory inoculation with high RA-doses (~1010 CFU per bird) resulted in systemic RA-infection, mild clinical signs and gross lesions, such as pericarditis and airsacculitis. The severity of the disease was considerably milder than observed in RA-outbreaks in turkey flocks under field conditions. Exposure of turkeys to a RA-rich aerosol (~1011 CFU/ml) at three to five days after inoculation with aMPV did not result in exacerbation of the disease, as compared to turkeys receiving RA mono-infection. Intransal inoculation of aMPV-infected turkeys with low RA-doses (~105 CFU per bird) resulted in respiratory and systemic RA-infection, while no RA was re-isolated from RA-inoculated turkeys which had not been exposed to aMPV. These results show that ciliostatic agents, such as aMPV, have considerable predisposing effects for the establishment of RA-infection in turkey flocks. However, additional infectious and/or non-infectious factors may be necessary to reproduce severe clinical disease as reported from the field. In summary this thesis provides new data on the pathogenesis of aMPV-infection in turkeys. In particular it emphasizes the important role of T-lymphocytes in the clearance of aMPV and in the protection against subsequent challenge infection. The results of this study will contribute to a better understanding of the protection of turkeys against aMPV and may facilitate future research on aMPV vaccination strategies.

Das Aviäre Metapneumovirus (aMPV) ist bei Puten ein wirtschaftlich bedeutender Infektionserreger und Verursacher einer akuten Atemwegserkrankung mit dem Namen „Rhinotracheitis der Puten“ (turkey rhinotracheitis, TRT). Bisher ist nur wenig bekannt über die Immunmechanismen, die für den Schutz gegen das Virus verantwortlich sind. Insbesondere die Bedeutung der T-Lymphozyten ist noch weitgehend unbekannt. Zielsetzung dieses Projektes war daher, weitergehende Informationen zur Rolle von humoraler und Zell-vermittelter Immunität für die Kontrolle der aMPV-Infektion der Pute zu sammeln. Zwei Teilstudien wurden zur Bearbeitung dieser Fragestellung im Rahmen dieses Projektes durchgeführt. Die erste Teilstudie befasst sich mit dem Schutz durch aMPV-spezifische Antikörper (Kapitel 4). Dazu wurde ein Puten-Hyperimmunserum gegen den aMPV Subtyp A (aMPV-A) hergestellt und die Antikörper aufkonzentriert. Puten wurden mit dieser Antikörper-Präparation durch intravenöse Injektion passiv immunisiert. Dies führte sowohl im Blut als auch auf den Atemwegsschleimhäuten der passiv immunisierten Puten zu hohen Virus-neutralisierenden (VN) und ELISA Antikörper-Spiegeln. Nach der anschließenden Belastungsinfektion mit einem virulenten aMPV-A Stamm wurden folgende Parameter über einen Zeitraum von 14 Tagen aufgenommen und zwischen infizierten Tieren mit und ohne aMPV-spezifischen Antikörpern verglichen: aMPV-Nachweis mittels RT-PCR, klinische Symptomatik und histopathologische Veränderungen der Schleimhäute von Trachea und Nasenmuscheln. Dabei konnten keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden. Dieses Ergebnis bestätigt vorherige Vermutungen, dass die humorale Immunität alleine keinen Schutz gegen die aMPV-Infektion bei der Pute bietet. Ziel der zweiten Teilstudie war die Untersuchung der Bedeutung von T-Lymphozyten für die Kontrolle der aMPV-Infektion. Dabei ging es zum einen um ihre Rolle bei der primären aMPV-Infektion (Kapitel 5), zum anderen um ihren Beitrag zum Impfschutz gegen aMPV (Kapitel 6). Diese Untersuchungen wurden in einem Immunsuppressions-Modell durchgeführt, in dem Puten durch Behandlung mit dem Wirkstoff Cyclosporin A (CsA) selektiv T-Zell-supprimiert wurden. Die T-Zell-suppressive Wirkung von CsA bei der Pute wurde mit Hilfe eines in vitro Proliferations-Tests nachgewiesen. CsA-Konzentrationen im Bereich von 0.25 bis 1 µg/ml verhinderten vollständig die Proliferation von T-Lymphozyten nach Mitogen-Stimulation. Die CsA-Behandlung der Puten erfolgte durch intramuskuläre Injektionen von 100 mg CsA pro kg Körpergewicht in drei- bis viertägigen Abständen. Die Wirkung im Tier wurde mittels durchflusszytometrischer Bestimmung absoluter Lymphozyten-Zahlen im Blut bestätigt. Die Anzahl CD4- und CD8a-positiver T-Lymphozyten im Blut CsA-behandelter Puten war im Vergleich zu den Kontrolltieren signifkant (P<0.05) um bis zu 80% verringert. Um die Rolle der T-Zellen während der primären aMPV-Infektion zu untersuchen (Kapitel 5), wurden CsA-behandelte und unbehandelte Puten mit virulentem aMPV-A infiziert. Zwei Versuche mit weitgehend identischem Versuchsaufbau führten dabei zu vergleichbaren Ergebnissen. T-Zell-Suppression durch CsA-Behandlung führte zu einer verzögerten Elimination des Erregers. An Tag 14 nach Infektion (post infection, PI) waren noch 38 bzw. 63 % der Tupferproben in den CsA-behandelten Gruppen aMPV-positiv, während in den unbehandelten Gruppen zur gleichen Zeit nur noch 0 bzw. 13 % positive Tupfer gefunden wurden. Gleichzeitig konnte ein verzögertes Abklingen der klinischen Symptomatik in den CsA-behandelten Gruppen beobachtet werden und Lä-sionen der Atemwegsschleimhäute waren ebenfalls länger feststellbar. Zusammengefasst weisen die Ergebnisse dieses Versuchsteils darauf hin, dass T-Lymphozyten eine große Bedeutung für die Kontrolle primärer aMPV-Infektionen bei der Pute haben. Ähnliche Ergebnisse konnten mit mehreren, mit dem aMPV verwandten Vertretern der Pneumovirinae in Säugetieren erzielt werden. Zur Untersuchung der Bedeutung der T-Lymphozyten für den Impfschutz gegen aMPV (Kapitel 6) wurden CsA-behandelte und unbehandelte Puten zunächst mit einem kommerziellen aMPV-A Lebendimpfstoff geimpft und zwei Wochen später durch Infektion mit virulentem aMPV-A belastet. Zwischen den drei durchgeführten Versuchen wurden erhebliche Variationen festgestellt in Bezug auf Nachweis der Lebendvakzine, Impfstoff-induzierte klinische Erkrankung, Antikörper-Antwort und Impfschutz. CsA-behandelte Puten entwickelten in zwei der drei Experimente trotz T-Zell-Suppression einen ausreichenden Schutz gegen die Belastungsinfektion. In diesen beiden Experimenten war der Lebendimpfstoff über einen Zeitraum von mehreren Tagen in den Tieren nachweisbar gewesen. Im dritten Versuch war dagegen kaum eine Vermehrung des Impfstoffes in den Puten nachweisbar und die CsA-behandelten Tiere entwickelten keinerlei Impfschutz. Die Ergebnisse dieses Versuchs deuten darauf hin, dass eine Suppression der T-Lymphozyten zu einem Impfversagen führen kann und T-Zellen somit eine Bedeutung für den Impfschutz gegen die aMPV-Infektion der Pute haben. Auf der anderen Seite zeigen die Ergebnisse der anderen beiden Versuche jedoch auch, dass die Verwendung von CsA im T-Zell-Suppressions-Modell nicht ohne Nachteile ist. Wir vermuten, dass die durch CsA verursachte Hemmung der T-Zellen bei ausreichender Stimulation des Immunsystems durch den Impfstoff kompensiert werden kann. Neben der primären pathogenen Wirkung von aMPV spielt in der Pathogenese dieses Erregers vor allem die Begünstigung von Sekundärinfektionen eine bedeutende Rolle. Die von aMPV hervorgerufenen Schleimhautläsionen im Respirationstrakt können von bakteriellen Atemwegserregern genutzt werden, um in den Organismus einzudringen. Das Gram-negative Bakterium Riemerella anatipestifer (RA) wird in Deutschland häufig in erkrankten Putenbeständen isoliert, insbesondere in Regionen mit hoher Dichte von Geflügelbeständen. Ein gemeinsames Auftreten von aMPV und RA wird dabei nicht selten beobachtet, so dass ein Zusammenhang zwischen beiden Infektionen diskutiert wird. Um diesen Aspekt näher zu beleuchten, wurde eine dritte Teilstudie dieses Projekts durchgeführt (Kapitel 7). Dazu wurde zunächst ein Infektionsmodell für die RA-Infektion der Pute durch Inokulation über den Respirationstrakt etabliert. Es zeigte sich, dass der Einsatz hoher RA-Infektionsdosen (>1010 KBE pro Tier) zu einer systemischen Infektion und der Ausbildung von milden klinischer Symptome und pathologischen Veränderungen führte. Die Organveränderungen, wie z.B. fibrinöse Beläge auf Herzbeutel und Luftsäcken, unterschieden sich in ihrer Art nicht von den bei RA-Infektionen im Feld beobachteten, sie waren jedoch weit weniger ausgeprägt. Experimentelle Infektionen von Puten mit aMPV, drei bis fünf Tage später gefolgt von hohen RA-Dosen durch Aerosol, führten nicht zu einer deutlicheren Ausprägung der Erkrankung im Vergleich zu nur mit RA infizierten Tieren. Wurden jedoch aMPV-infizierte und Virus-freie Tiere durch intranasale Inokulation mit niedrigeren RA-Dosen (>105 KBE pro Tier) infiziert, so zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Während aus den aMPV-freien Puten in den folgenden Tagen kein RA isoliert werden konnte, entwickelte sich bei den aMPV-infizierten Tieren eine RA-Infektion mit Nachweis des Bakteriums aus respiratorischen und inneren Organen. Dies zeigt, dass aMPV eine bedeutende Rolle für das Haften der RA-Infektion in Puten unter Feldbedingungen spielen kann. Die Entwicklung schwerer klinischer Erkrankungen, wie sie von RA-Ausbrüchen in Putenbeständen berichtet werden, scheint jedoch vom zusätzlichen Einfluss weiterer belastender Faktoren abhängig zu sein. Zusammenfassend bietet diese PhD-These neue Informationen zur Pathogenese der aMPV-Infektion der Pute. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass T-Lymphozyten einen wichtigen Beitrag zur Kontrolle der Infektion im Tier leisten. Die Ergebnisse dieser Studie tragen somit zu einem besseren Verständnis der Immunität gegen die aMPV-Infektion bei.

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Rubbenstroth, Dennis: Studies on pathogenesis of avian Metapneumovirus (aMPV) infection in turkeys and the role of immune mechanisms for the protection against aMPV. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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