Studies on pathogenesis of avian Metapneumovirus (aMPV) infection in turkeys and the role of immune mechanisms for the protection against aMPV

Das Aviäre Metapneumovirus (aMPV) ist bei Puten ein wirtschaftlich bedeutender Infektionserreger und Verursacher einer akuten Atemwegserkrankung mit dem Namen „Rhinotracheitis der Puten“ (turkey rhinotracheitis, TRT). Bisher ist nur wenig bekannt über die Immunmechanismen, die für den Schutz gegen das Virus verantwortlich sind. Insbesondere die Bedeutung der T-Lymphozyten ist noch weitgehend unbekannt. Zielsetzung dieses Projektes war daher, weitergehende Informationen zur Rolle von humoraler und Zell-vermittelter Immunität für die Kontrolle der aMPV-Infektion der Pute zu sammeln. Zwei Teilstudien wurden zur Bearbeitung dieser Fragestellung im Rahmen dieses Projektes durchgeführt. Die erste Teilstudie befasst sich mit dem Schutz durch aMPV-spezifische Antikörper (Kapitel 4). Dazu wurde ein Puten-Hyperimmunserum gegen den aMPV Subtyp A (aMPV-A) hergestellt und die Antikörper aufkonzentriert. Puten wurden mit dieser Antikörper-Präparation durch intravenöse Injektion passiv immunisiert. Dies führte sowohl im Blut als auch auf den Atemwegsschleimhäuten der passiv immunisierten Puten zu hohen Virus-neutralisierenden (VN) und ELISA Antikörper-Spiegeln. Nach der anschließenden Belastungsinfektion mit einem virulenten aMPV-A Stamm wurden folgende Parameter über einen Zeitraum von 14 Tagen aufgenommen und zwischen infizierten Tieren mit und ohne aMPV-spezifischen Antikörpern verglichen: aMPV-Nachweis mittels RT-PCR, klinische Symptomatik und histopathologische Veränderungen der Schleimhäute von Trachea und Nasenmuscheln. Dabei konnten keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden. Dieses Ergebnis bestätigt vorherige Vermutungen, dass die humorale Immunität alleine keinen Schutz gegen die aMPV-Infektion bei der Pute bietet. Ziel der zweiten Teilstudie war die Untersuchung der Bedeutung von T-Lymphozyten für die Kontrolle der aMPV-Infektion. Dabei ging es zum einen um ihre Rolle bei der primären aMPV-Infektion (Kapitel 5), zum anderen um ihren Beitrag zum Impfschutz gegen aMPV (Kapitel 6). Diese Untersuchungen wurden in einem Immunsuppressions-Modell durchgeführt, in dem Puten durch Behandlung mit dem Wirkstoff Cyclosporin A (CsA) selektiv T-Zell-supprimiert wurden. Die T-Zell-suppressive Wirkung von CsA bei der Pute wurde mit Hilfe eines in vitro Proliferations-Tests nachgewiesen. CsA-Konzentrationen im Bereich von 0.25 bis 1 µg/ml verhinderten vollständig die Proliferation von T-Lymphozyten nach Mitogen-Stimulation. Die CsA-Behandlung der Puten erfolgte durch intramuskuläre Injektionen von 100 mg CsA pro kg Körpergewicht in drei- bis viertägigen Abständen. Die Wirkung im Tier wurde mittels durchflusszytometrischer Bestimmung absoluter Lymphozyten-Zahlen im Blut bestätigt. Die Anzahl CD4- und CD8a-positiver T-Lymphozyten im Blut CsA-behandelter Puten war im Vergleich zu den Kontrolltieren signifkant (P<0.05) um bis zu 80% verringert. Um die Rolle der T-Zellen während der primären aMPV-Infektion zu untersuchen (Kapitel 5), wurden CsA-behandelte und unbehandelte Puten mit virulentem aMPV-A infiziert. Zwei Versuche mit weitgehend identischem Versuchsaufbau führten dabei zu vergleichbaren Ergebnissen. T-Zell-Suppression durch CsA-Behandlung führte zu einer verzögerten Elimination des Erregers. An Tag 14 nach Infektion (post infection, PI) waren noch 38 bzw. 63 % der Tupferproben in den CsA-behandelten Gruppen aMPV-positiv, während in den unbehandelten Gruppen zur gleichen Zeit nur noch 0 bzw. 13 % positive Tupfer gefunden wurden. Gleichzeitig konnte ein verzögertes Abklingen der klinischen Symptomatik in den CsA-behandelten Gruppen beobachtet werden und Lä-sionen der Atemwegsschleimhäute waren ebenfalls länger feststellbar. Zusammengefasst weisen die Ergebnisse dieses Versuchsteils darauf hin, dass T-Lymphozyten eine große Bedeutung für die Kontrolle primärer aMPV-Infektionen bei der Pute haben. Ähnliche Ergebnisse konnten mit mehreren, mit dem aMPV verwandten Vertretern der Pneumovirinae in Säugetieren erzielt werden. Zur Untersuchung der Bedeutung der T-Lymphozyten für den Impfschutz gegen aMPV (Kapitel 6) wurden CsA-behandelte und unbehandelte Puten zunächst mit einem kommerziellen aMPV-A Lebendimpfstoff geimpft und zwei Wochen später durch Infektion mit virulentem aMPV-A belastet. Zwischen den drei durchgeführten Versuchen wurden erhebliche Variationen festgestellt in Bezug auf Nachweis der Lebendvakzine, Impfstoff-induzierte klinische Erkrankung, Antikörper-Antwort und Impfschutz. CsA-behandelte Puten entwickelten in zwei der drei Experimente trotz T-Zell-Suppression einen ausreichenden Schutz gegen die Belastungsinfektion. In diesen beiden Experimenten war der Lebendimpfstoff über einen Zeitraum von mehreren Tagen in den Tieren nachweisbar gewesen. Im dritten Versuch war dagegen kaum eine Vermehrung des Impfstoffes in den Puten nachweisbar und die CsA-behandelten Tiere entwickelten keinerlei Impfschutz. Die Ergebnisse dieses Versuchs deuten darauf hin, dass eine Suppression der T-Lymphozyten zu einem Impfversagen führen kann und T-Zellen somit eine Bedeutung für den Impfschutz gegen die aMPV-Infektion der Pute haben. Auf der anderen Seite zeigen die Ergebnisse der anderen beiden Versuche jedoch auch, dass die Verwendung von CsA im T-Zell-Suppressions-Modell nicht ohne Nachteile ist. Wir vermuten, dass die durch CsA verursachte Hemmung der T-Zellen bei ausreichender Stimulation des Immunsystems durch den Impfstoff kompensiert werden kann. Neben der primären pathogenen Wirkung von aMPV spielt in der Pathogenese dieses Erregers vor allem die Begünstigung von Sekundärinfektionen eine bedeutende Rolle. Die von aMPV hervorgerufenen Schleimhautläsionen im Respirationstrakt können von bakteriellen Atemwegserregern genutzt werden, um in den Organismus einzudringen. Das Gram-negative Bakterium Riemerella anatipestifer (RA) wird in Deutschland häufig in erkrankten Putenbeständen isoliert, insbesondere in Regionen mit hoher Dichte von Geflügelbeständen. Ein gemeinsames Auftreten von aMPV und RA wird dabei nicht selten beobachtet, so dass ein Zusammenhang zwischen beiden Infektionen diskutiert wird. Um diesen Aspekt näher zu beleuchten, wurde eine dritte Teilstudie dieses Projekts durchgeführt (Kapitel 7). Dazu wurde zunächst ein Infektionsmodell für die RA-Infektion der Pute durch Inokulation über den Respirationstrakt etabliert. Es zeigte sich, dass der Einsatz hoher RA-Infektionsdosen (>1010 KBE pro Tier) zu einer systemischen Infektion und der Ausbildung von milden klinischer Symptome und pathologischen Veränderungen führte. Die Organveränderungen, wie z.B. fibrinöse Beläge auf Herzbeutel und Luftsäcken, unterschieden sich in ihrer Art nicht von den bei RA-Infektionen im Feld beobachteten, sie waren jedoch weit weniger ausgeprägt. Experimentelle Infektionen von Puten mit aMPV, drei bis fünf Tage später gefolgt von hohen RA-Dosen durch Aerosol, führten nicht zu einer deutlicheren Ausprägung der Erkrankung im Vergleich zu nur mit RA infizierten Tieren. Wurden jedoch aMPV-infizierte und Virus-freie Tiere durch intranasale Inokulation mit niedrigeren RA-Dosen (>105 KBE pro Tier) infiziert, so zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Während aus den aMPV-freien Puten in den folgenden Tagen kein RA isoliert werden konnte, entwickelte sich bei den aMPV-infizierten Tieren eine RA-Infektion mit Nachweis des Bakteriums aus respiratorischen und inneren Organen. Dies zeigt, dass aMPV eine bedeutende Rolle für das Haften der RA-Infektion in Puten unter Feldbedingungen spielen kann. Die Entwicklung schwerer klinischer Erkrankungen, wie sie von RA-Ausbrüchen in Putenbeständen berichtet werden, scheint jedoch vom zusätzlichen Einfluss weiterer belastender Faktoren abhängig zu sein. Zusammenfassend bietet diese PhD-These neue Informationen zur Pathogenese der aMPV-Infektion der Pute. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass T-Lymphozyten einen wichtigen Beitrag zur Kontrolle der Infektion im Tier leisten. Die Ergebnisse dieser Studie tragen somit zu einem besseren Verständnis der Immunität gegen die aMPV-Infektion bei.