Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Implication of gliadin toxicity on actin integrity and subsequent protein trafficking in vitro

Reinke, Yvonne

Celiac disease (CD) is a chronic inflammation of the small intestine due to ingestion of gluten in genetically predisposed individuals (HLA-DQ2/DQ8). While there has been great progress in some areas of CD, e.g. diagnostic, genetic aspects, or immunology, the molecular basis of the mucosal damage, especially at the outset of etiopathology, is poorly understood. It has been described that treatment with gliadin peptides leads to morphological alterations of the actin cytoskeleton in both biopsy specimens and Caco-2 cells. This points to a possible role of actin during early steps in the pathogenesis of CD, since actin is a key player in a variety of cellular events e.g. cell shape, protein transport and sorting, and endocytosis. For these reasons, the present study was aimed to elucidate the gliadin-induced rearrangements of the actin cytoskeleton on the molecular level and to investigate this effect on subsequent protein trafficking. Employment of discriminative experimental procedures revealed new insights into immediate effects on two different cell types (COS-1 and Caco-2) due to exposure with Frazer’s Fraction (FF), the source of gliadin peptides. Initial investigations with COS-1 cells that were treated with FF revealed morphological alterations in the actin filaments, which appeared as fragmented and aggregated structures in confocal laser microscopy. This observation indicates deterioration in the integrity of the actin cytoskeleton. Interestingly, there was a decrease of immunoprecipitated radio-active labeled actin, which suggests conformational changes. Leading thus to an altered antibody-binding capacity of actin. In contrast to FF, cytochalasin D (cytoD) induced a very drastic disruption of actin, which led to its accumulation in dense foci and patches concomitant with alteration in the cell shape. Moreover, actin was only partially reduced in immunoisolates from cytoD-treated cells. Therefore, the effect of FF appears to be different from that of cytoD. On the other hand, a peptic-tryptic digest of ovalbumin (OVA), that represents another food antigen, has no effect on actin neither in COS-1 cells nor in Caco-2 cells indicating that the effect on actin is gliadin-specific. Stimulation of Caco-2 cells with FF revealed also changes in the integrity of the actin network. In intestinal epithelial cells, the brush border is formed by a huge number of microvilli that are maintained by numerous actin filaments connected to the overlying brush border membrane (BBM) and the adjacent actin network. Isolation of BBMs from FF- stimulated Caco-2 cells showed a strong reduction of actin in the BBM-fraction which suggests a decrease in the association of actin with the BBM. Interestingly, α-tubulin displayed in turn an increase in the protein level indicating a compensational effect.  The alteration of the actin cytoskeleton is presumably induced by direct interaction of FF-deriving gliadin peptides with actin or, more likely, actin binding proteins. Here, confocal imaging of FF-treated COS-1 cells showed a clear co-localization of the “„toxic“” gliadin peptide 31-49 with the actin cytoskeleton and co-immunoprecipitation revealed an increase of actin in the immunoisolates with time. On the other hand, Caco-2 cells displayed an alternating binding pattern of co-immunoprecipitated actin after prolonged stimulation up to 72h although the amount of actin in total lysates remains the same. A varying binding pattern together with the appearance of actin fragments in confocal images after FF-stimulation suggests a favored binding of gliadin peptides to the filamentous form of actin. The alterations of the actin cytoskeleton elicited impaired protein trafficking of intestinal sucrase-isomaltase (SI), a glycoprotein that follows an actin-dependent vesicular transport to the cell surface. This came along with reduced enzymatic function of SI in the BBM-fraction of Caco-2 cells. The transport of aminopeptidase N (ApN) and dipeptidylpeptidase IV (DPPIV) was only partially affected by FF. This is presumably due to their property to follow both a direct and a transcytotic pathway to the BBM. The latter pathway involves predominantly microtubules. By contrast, the actin-independent protein transport, as monitored by transport of the representative protein intestinal lactase phlorizin hydrolase (LPH), remains unaffected. In addition to anterograde transport processes, actin-dependent retrograde events are also found to be hampered by FF stimulation. Vesicles that are released from the trans-Golgi network do not only contain proteins but also lipids as SI associates with membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingomyelin. Normally, these lipids are often internalized and recycle back to the plasma membrane. The establishment of an assay using biotinylated wheat germ agglutinin (WGA) provides an opportunity to assess the endocytic capability of treated and non-treated Caco-2 cells. The data revealed a substantially block of the endocytic pathway in FF-treated cells that led to an accumulation of cholesterol, and sphingolipids in the BBM.   Altogether, the data demonstrate that FF deteriorates the actin cytoskeleton in COS-1 cells and Caco-2 cells by direct interaction with actin or, more likely, actin binding proteins leading thus to altered integrity. Consequently, this results in reduced protein trafficking and hampered endocytic events with subsequent alterations in the protein and lipid composition of the BBM. The reduced levels of the disaccharidase SI in the BBM suggest therefore a potential pathomechanism of carbohydrate malabsorption in CD.

Zöliakie ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des Dünndarms, die bei genetisch prädisponieren Personen (HLA-DQ2/DQ8) durch die Einnahme von Gluten hervorgerufen wird. Während es im Bereich der Diagnostik, der Genetik und der Immunologie große Fortschritte gab, ist über die molekulare Grundlage der mukosalen Beschädigung des Dünndarms nur wenig bekannt. Es wurde bereits beschrieben, dass die Behandlung mit Gliadin Peptiden zu Veränderungen des Aktinzytoskeletts in Biopsien und Caco-2 Zellen führt. Demnach könnte Aktin eine Rolle in der frühen Pathogenese der Zöliakie spielen, denn Aktin ist an einer Vielzahl zellulärer Ereignisse, wie zum Beispiel der Formgebung der Zelle, Proteintransport und Sortierung und Endozytose beteiligt. Aus diesen Gründen beschäftigte sich diese Arbeit mit den molekularen Hintergründen der Gliadin-bedingten Reorganisation des Aktinzytoskeletts und mit den daraus resultierenden Konsequenzen für den aktin-abhängigen Proteintransport. Durch den Einsatz verschiedener experimenteller Methoden und der Verwendung von zwei unterschiedlichen Zelllinien (COS-1 und Caco-2), konnten neue Einblicke hinsichtlich direkter, unverzüglicher Effekte von Frazer’s Fraktion (FF), der Quelle für Gliadin Peptide, gewonnen werden. In einleitenden Untersuchungen mit COS-1 Zellen konnten nach der Behandlung mit FF morphologische Veränderungen der Aktinfilamente festgestellt werden, die im Konfokalen Lasermikroskop als Fragmente oder Aggregate zu erkennen waren. Derartige Veränderungen führen zu einer verminderten Integrität des Aktinzytoskeletts. Interessanterweise zeigte sich eine Abnahme in den Immunisolaten von radioaktiv markiertem Aktin. Dies könnte auf eine Konformationsänderung von Aktin zurückzuführen sein, die zu einer verminderten Antikörperbindungskapazität führt. Ein Vergleich zwischen den Effekten von Cytochalasin D (CytoD) und Gliadin konnte für Gliadin ein anderen Wirkmechanismus aufzeigen. CytoD ruft eine drastische Zerstörung von Aktin hervor die zu einer stark konzentrierten Akkumulation von Aktin in bestimmten Bereichen der Zelle führt und mit einer Veränderung der Zellform einhergeht. Zusätzlich konnte hier nur eine geringe Abnahme von Aktin in den Immunisolaten festegestellt werden, was ebenfalls auf eine andere Art von Interaktion hinweist. Im Gegensatz dazu hat pepsin-trypsin verdautes Ovalbumin (OVA), das als Kontrollantigen eingesetzt wurde, keinerlei Einfluss auf das Aktinzytoskelett, weder in COS-1 Zellen noch in Caco-2 Zellen, was auf einen Gliadin-spezifischen Effekt hindeutet. In Caco-2 Zellen ruft die Stimulation mit FF ebenfalls eine Änderung in der Integrität des Aktinnetzwerk hervor. In intestinalen Epithelzellen wird der Bürstensaum von einer großen Anzahl von Mikrovilli gebildet, die durch zahlreiche Aktinfilamente, die mit der Bürstensaummembran (BBM) und dem darunterliegenden Aktinnetzwerk verbunden sind, aufrechterhalten wird. Die Isolation der BBM von FF-behandelten Caco-2 Zellen zeigte eine starke Reduktion von Aktin in der BBM-Fraktion, die auf eine geringere Assoziation von Aktin mit der BBM schließen lässt. Interessanterweise konnte für α-Tubulin eine Zunahme in der BBM-Fraktion beobachtet werden, die auf einen ausgleichenden Effekt hindeutet. Die morphologischen Veränderungen von Aktin sind vermutlich auf eine direkte Interaktion von Gliadin Peptiden mit Aktin oder, was wahrscheinlicher ist, Aktin-bindenden Proteinen zurückzuführen. Anhand konfokaler Aufnahmen von FF-stimulierten COS-1 Zellen konnte für das toxische Gliadin Peptid 31-49 eine klare Kolokalisation mit dem Aktinzytoskelett festgestellt werden und Ko-Immunpräzipitationsversuche zeigten eine zeitabhängige Zunahme von Aktin in den Isolaten von FF-behandelten COS-1 Zellen. In Caco-2 Zellen hingegen wurde über einen verlängerten Behandlungszeitraum bis zu 72h eine alternierende Bindung von Gliadin Peptiden und Aktin oder Aktin-bindenden Proteinen beobachtet ohne dass sich die Gesamtkonzentration von Aktin verändert hatte. Die Variationen im Bindungsmuster und das Auftreten von Aktinfragmenten nach Behandlung mit FF weisen auf eine bevorzugte Interaktion von Gliadin Peptiden mit filamentösem Aktin hin. Das durch die FF-Behandlung veränderte Aktinzytoskeletts führt zu einem stark eingeschränkten Proteintransport der intestinalen Saccharase-Isomaltase (SI), einem Glykoprotein, das einem aktin-abhängigen Transport zur Zelloberfläche folgt. Gleichzeitig konnte in Caco-2 Zellen auch eine verminderte Enzymaktivität der SI in der BBM festgestellt werden. Der Transport von Aminopeptidase N (ApN) und Dipeptidylpeptidase IV (DPPIV) hingegen ist nur teilweise betroffen. Dieser Effekt ist wahrscheinlich damit zu erklären, dass sie sowohl auf direkten als auch über einen transzytotischen Weg zur BBM transportiert werden, wobei der zuletzt genannte Weg vorallem über Mikrotubuli erfolgt. Im Gegensatz dazu ist der Aktin-unabhängige Transport, der durch die intestinale Laktase Phlorizin Hydrolase repräsentiert wird, in keiner Weise eingeschränkt. Neben der Beeinträchtigung von anterograden Transportprozessen zeigten sich auch retrograde Prozesse, die auf Aktin angewiesen sind, durch die FF-Stimulation gehemmt. Vesikel, die vom trans-Golgi Netzwerk (TGN) entlassen werden, enthalten nicht nur Proteine sondern auch Lipide. So ist die SI mit Membranmikrodomänen assoziiert, die reich sind an Cholesterol und Sphingomyelin. Normalerweise werden diese Lipide internalisiert und dann oft zur Plasmamembran zurücktransportiert. Die Etablierung eines Endozytose Essays mit biotinyliertem Weizenkeimagglutinin (WGA) deckte einen nicht unwesentlichen Block endozytotischer Ereignisse auf, die zu einer Anreicherung von Cholesterol und Sphingolipiden in der BBM führt. Zusammenfassend konnten die Daten demonstrieren, dass FF das Aktinzytoskelett von COS-1 Zellen und Caco-2 Zellen beeinflusst, indem es direkt mit Aktin oder Aktin-bindenden Proteinen interagiert und damit dessen Integrität verändert. Daraus resultieren ein verminderter Proteintransport und eingeschränkte endozytotische Prozesse die folglich zu einer veränderten Protein- und Lipidzusammensetzung der BBM führen. Die Abnahme der Disaccharidase SI in der BBM könnte dabei einen potentiellen Pathomechanismus der Kohlenhydratmalabsorption in der Zöliakie darstellen.

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Reinke, Yvonne: Implication of gliadin toxicity on actin integrity and subsequent protein trafficking in vitro. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.

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