Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Physiological and molecular comparison of susceptible and anthelmintic-resistant isolates of cattle parasitic nematodes

Demeler, Janina

Anthelmintic resistance against all commonly used classes of anthelmintic drugs is an increasing problem in the livestock industries and animal welfare throughout the world. It first appeared in gastro intestinal nematodes of small ruminants (Echevarria et al., 1996; Gopal et al., 1999; Vickers et al., 2001) and is rapidly increasing in those of horses (Kaplan, 2004; Molento et al., 2008; Traversa et al., 2009) and cattle (Soutello et al., 2007; Suarez and Cristel, 2007; Waghorn et al., 2006). Despite all current approaches in changing management and drenching routines, the effective chemical anthelmintics remain irreplaceable for worm control, as other possibilities, such as vaccines which might provide a long-term solution, are still many years from the market. Since knowledge regarding the spread of anthelmintic resistance in cattle gastrointestinal nematodes in Europe was largely limited to the United Kingdom, one of the first aims of the project was the documentation of the resistance status using the faecal egg count reduction test in vivo in Belgium, Sweden and Germany. Resistance was defined according to the guidelines of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology for the faecal egg count reduction test, with a mean faecal egg count reduction below 95% and a lower confidence interval below 90% (Coles et al., 1992). Indeed, resistant Cooperia spp. could be frequently identified in all three countries, with 57-67%, 80-100% and 75-83% of all tested farms in Belgium, Sweden and Germany, respectively. In Germany and particularly in Sweden, a few resistant populations of the more pathogenic O. ostertagi were also found. Cooperia spp. has long been known to be the dose limiting species for treatment of cattle with macrocyclic lactones (Benz et al., 1989; Vercruysse and Rew, 2002) and macrocyclic lactone resistance in gastro intestinal nematodes has been predicted to occur first in Cooperia (Coles, 2002). The results presented in this survey indicate that the anthelmintic efficacy of ivermectin may be frequently incomplete in cattle nematodes in Europe. Despite its widespread occurrence, resistance is apparently only rarely recognized by the farmers. One reason for this maybe the fact, that predominantly the less pathogenic species C. oncophora survives ivermectin treatment. However, monoinfections which can cause diarrhoea, decreased appetite and a loss in weight gain can also result in significant economic losses. The major advantage of the faecal egg count reduction test is its suitability with all drug classes. Despite this, the faecal egg count reduction test suffers from several practical limitations. Most important, it assumes that the number of eggs in the faeces is correlated to the worm burden. However, there are several reports showing that this assumption is not valid (Anderson, 2000; Eysker and Ploeger, 2000; Vercauteren et al., 2004). On one hand, it could be shown that egg production of gastro intestinal nematodes is density dependent (Brunsdon, 1971; Michel, 1969). Increased egg production of a few surviving worms (Kanobana et al., 2001) may lead to overestimation of anthelmintic resistance. On the other hand, macrocyclic lactones cause a transient suppression of egg laying in female worms (Le Jambre et al., 1995) which can cause underestimation of drug resistance. Furthermore the interpretation of faecal egg counts in cattle is difficult due to mixed populations of adult and immature worms of different species and varying egg production over time (Jackson et al., 2006). The faecal egg count reduction test is quite insensitive in detection of drug resistance – in particular if the infection pressure is low as in our study during the warm and dry summer in 2006. Moreover, the test does not allow to precisely quantify the extent of drug resistance as no dose response data can be obtained. However, using a faecal egg count reduction test allows gaining an overview of the current situation in the field and gives the possibility to go back to farms with suspected incomplete efficacy for further examination. In contrast, in vitro tests for drug sensitivity can provide quantitative data on the extent of resistance, are cheap and relatively rapid to perform. They are therefore suitable to provide more detailed information about emerging resistance to anthelmintics. In sheep parasitic nematodes, parasite populations highly resistant against benzimidazoles or macrocyclic lactones in vivo were also found to be less susceptible in vitro in the larval development test (Gill et al., 1995; Giordano et al., 1988; Hubert and Kerboeuf, 1992; Lacey et al., 1990; Taylor, 1990). Although several in vitro tests are available for sheep gastro intestinal nematodes, no such tests had been described for cattle parasites prior to the start of the PARASOL project. For benzimidazoles the egg hatch test is the most suitable in vitro test, which is fast and simple to perform. For thiabendazole discriminating doses have been established so that this test can be used to evaluate the resistance status of field populations to benzimidazoles. Within the recent PARASOL project, we successfully adapted a protocol developed for sheep gastro intestinal nematodes and standardized the egg hatch test for the cattle nematodes Cooperia and Ostertagia using thiabendazole (von Samson-Himmelstjerna et al., 2009a). In the described field study, benzimidazoles were found to be still efficient on all farms tested, while incomplete efficacy was found for ivermectin. Macrocyclic lactone anthelmintics have no ovicidal activity and therefore the egg hatch test can not be used to detect resistance to ivermectin. Other in vitro tests such as the larval development test or the larval migration inhibition test are technically suitable to be used with macrocyclic lactones. In sheep parasitic nematodes this test has been standardized for the detection of resistance against benzimidazoles and levamisole (Gill et al., 1995) and is commercially available (DrenchRite®). The  DrenchRite® test has also been evaluated for its use in horses (Tandon and Kaplan, 2004). The work presented here (Demeler et al., accepted) describes the first development and evaluation of such in vitro tests to monitor drug efficacy in C. oncophora and O. ostertagi. While the larval migration inhibition test was relatively easy to adapt for cattle parasites, the larval development test was more fragile and complex. Test parameters such as temperature, medium composition and incubation times had to be strictly observed, as both parasite species are less forgiving in terms of changes than comparable sheep nematodes. In the present study standard operating procedures for both in vitro tests were produced (Demeler et al., accepted). For the susceptible C. oncophora EC50 values of 3.19 nM and 123 nM were obtained for ivermectin in the larval migration inhibition test and the larval development test, respectively. The EC50 values for the ivermectin-resistant isolate were significantly higher, resulting in resistance ratios 5.05 and 5.30 in the larval migration inhibition test and the larval development test, respectively. Additionally to these two tests using free living stages of the parasites, the Micromotility Meter was evaluated for its use to detect resistance to ivermectin in adult C. oncophora. The EC50 values of ivermectin for both C. oncophora isolates were similar those obtained in the larval development test with 1.68 nM for the susceptible and 8.17 nM for the resistant isolate, resulting in a resistance ratio of 6.11. Although unsuitable for field studies, this method also proved to be meaningful for the detection of resistance to macrocyclic lactones. For the susceptible O. ostertagi isolate, ivermectin EC50 values of 1.64 nM and 404 nM were established for ivermectin in the larval development test and the larval migration inhibition test, respectively. Both test systems proved to be robust and reliable. The larval migration inhibition test was furthermore standardized through ring testing in six different laboratories, giving reproducible results for both species tested (Demeler et al., in preparation). The ability of the larval migration inhibition test to detect resistance to ivermectin in the field has also been evaluated in a recent field study (Kleinschmidt et al., in preparation). In order to establish cut off EC50 values for resistance to macrocyclic lactones, e.g. ivermectin, additional tests using drug resistant isolates of both species are needed. This is currently hindered by the fact, that field populations resistant to ivermectin are difficult to isolate and therefore are not easily assessable. Additional to the in vitro tests, molecular methods to identify resistance to anthelmintics have been developed. One key requirement for the development of such tests is the identification and the understanding of resistance mechanisms at the molecular level. While specific mechanisms of resistance have so far mainly been described for resistance to benzimidazoles (Prichard, 2001), there has unfortunately been limited success in identifying such mechanisms for resistance to macrocyclic lactone anthelmintics, which could lead the development of molecular markers for resistance. Additional to the specific mechanisms, unspecific mechanisms involving broad-spectrum xenobiotic detoxification systems have been frequently implicated in the development of resistance. In terms of anthelmintic resistance, recent research focused mainly on P-glycoproteins and related ABC transporters (Jones and George, 2005; Prichard and Roulet, 2007; Xu et al., 1998). Using the in vitro test systems established here, we analyzed the potential involvement of P-glycoproteins in ivermectin resistance in C. oncophora. The response to ivermectin of a susceptible and an ivermectin resistant isolate was compared in the absence and presence of verapamil, a potent inhibitor of P-glycoproteins. In both in vitro tests, the EC50 value for ivermectin shifted to the left when ivermectin and verapamil were used in combination. In the presence of verapamil, no significant difference between the EC50 values of the susceptible and the resistant isolate was detected. The results suggest that the inhibition of P-glycoprotein activity generally increases the susceptibility to ivermectin and predominantly contributes to the decreased response of ivermectin resistant isolates. Despite a larga amount of work performed in this field, no single P-glycoprotein has been shown to be responsible for resistance. In contrast to mammals the P-glycoprotein repertoire of nematodes is highly diverse, for instance there are fourteen functional P-glycoproteins encoded in the genome of Caenorhabditis elegans. The sheep parasitic nematode Haemonchus contortus has been shown to also encode several different P-glycoproteins and for O. ostertagi an orthologue of the C. elegans Pgp-2 has been described (Sangster et al., 1999; Van Zeveren et al., 2007; Xu et al., 1998). The large number of different P-glycoproteins suggests that the individual proteins have distinct but overlapping substrate spectra making it difficult to predict, which P-glycoprotein might be involved in the mechanisms leading to resistance to different types of drugs. In the present study we describe the first full length P-glycoprotein sequences for C. oncophora in addition to two small fragments. According to the phylogenetic maximum likelihood analysis the full length sequences correspond to the C. elegans genes Pgp-2 and Pgp-3, while the fragments were designated as ConPgp-12 and ConPgp-16. The Pgp-2 has previously been shown to play a role in resistance to macrocyclic lactones in H. contortus (Blackhall et al., 1998; Xu et al., 1998) and was hence chosen for further characterization in this study. Preliminary comparison of the primary sequence of the susceptible and ivermectin resistant C. oncophora isolate did not show any major sequence differences although a few single nucleotide polymorphisms were identified. However, none of these polymorphic sites correlated with the resistance phenotype. Nevertheless, more detailed sequence analysis involving additional susceptible and ivermectin resistant isolates are needed in the future to formally exclude the selection of certain ConPgp-2 alleles by ivermectin resistance. At least in the resistant isolates used in this study upregulation of ConPgp-2 does not contribute to the development of resistance to ivermectin, since real time RT-PCR revealed slightly lower ConPgp-2 mRNA levels in the resistant isolate, but this was not significant. Similar analysis should be performed with the described ConPgp-3 but also with additional, not yet identified members of the P-glycoprotein family. In order to further characterize the full substrate spectrum of individual P-glycoproteins and to estimate their potential contribution to the development of resistance to different classes of anthelmintics, functional expression in eukaryotic cells followed by transport studies will be required. The faecal egg count reduction test in vivo could be successfully used to screen for and identify resistant nematode populations in the field. For detailed characterization of the resistance status of such field populations, the in vitro tests described in this study are well suited since they successfully detect and quantify resistance to ivermectin in isolates of C. oncophora and O. ostertagi and were applicable for the analysis of potential involvement of P-glycoproteins in drug resistance of cattle nematodes. Together with the characterization of the first full length sequences of P-glycoproteins in C. oncophora the data presented in this study provide the framework which is necessary for detailed functional analysis of resistance mechanisms in the future on both, physiological and molecular level.

Resistenz gegen alle gegenwärtig genutzten Wirkstoffklassen ist ein zunehmendes Problem in der Tierproduktion sowie im Tierschutz weltweit. Resistenz trat zuerst bei Magen-Darm-Nematoden der kleinen Wiederkäuer auf (Echevarria et al., 1996; Gopal et al., 1999; Vickers et al., 2001) und nimmt auch bei Pferdenematoden (Kaplan, 2004; Molento et al., 2008; Traversa et al., 2009) und Rindernematoden (Soutello et al., 2007; Suarez and Cristel, 2007; Waghorn et al., 2006) rapide zu. Trotz der gegenwärtigen Ansätze, Management und Entwurmungsregime entsprechend zu verändern, sind die chemischen Anthelminthika nach wie vor unersetzlich bei der effektiven Kontrolle von Würmern. Impfstoffe, die eine Langzeitlösung sein könnten, sind immer noch Jahre von eine möglichen Markteinführung entfernt. Da Informationen über sich ausbreitende Resistenzen bei Rindernematoden in Europa weitgehend auf England beschränkt sind, war es eines der ersten Ziele dieses Projektes, die Resistenzsituation mittels des Eizahlreduktionstests in Belgien, Schweden und Deutschland in vivo zu dokumentieren. Nach den Richtlinien der „World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology“ wurde Resistenz auf einem Betrieb definiert, wenn die mittlere Eizahlreduktion unter 95% und das untere Konfidenzinterval unter 90% waren (Coles et al., 1992). Tatsächlich konnten in allen Ländern resistente Cooperia spp. auf Betrieben gefunden werden, wobei die Anzahl dieser Betriebe in Belgien zwischen 57-67%, in Schweden zwischen 80-100% und in Deutschland zwischen 75-83% lag. In Deutschland und vor allem aber in Schweden konnten außerdem einige resistente Ostertagia-Populationen nachgewiesen werden. Cooperia ist schon lange als die Dosis-limitierende Spezies bei der Behandlung mit Makrozyklischen Laktonen bekannt (Benz et al., 1989; Vercruysse and Rew, 2002) und daher wurde frühzeitig angenommen, das Resistenz gegen Makrozyklische Laktone zuerst in Cooperia auftritt (Coles, 2002). Die Ergebnisse der hier vorgestellten Studie zeigen, dass die anthelminthische Effizienz von Ivermectin gegenüber den Nematoden des Rindes in Europa häufig unvollständig ist. Trotz ihrer weiten Verbreitung wird Resistenz offenbar nur selten von Landwirten wahrgenommen. Ein Grund dafür mag die Tatsache sein, daß überwiegend die weniger pathogene Spezies Cooperia oncophora die Ivermectin-Behandlung überlebt. Monoinfektionen, welche Diarrhoe, Appetitlosigkeit und verringerte Gewichtszunahmen verursachen, können jedoch auch zu signifikanten ökonomischen Verlusten führen. Der wesentliche Vorteil des Eizahlreduktionstests liegt darin, daß er mit allen Klassen von Anthelminthika durchgeführt werden kann. Trotz dieses Vorteils hat der Eizahlreduktionstest praktische Einschränkungen. Vor allen Dingen setzt er voraus, daß die Anzahl der Eier im Kot mit der Wurmbürde korreliert. Es gibt jedoch etliche Berichte die zeigen, daß diese Annahme nicht valide ist (Anderson, 2000; Eysker and Ploeger, 2000; Vercauteren et al., 2004). Zum einen konnte gezeigt werden daß die Eiproduktion gastro-intestinaler Nematoden von der Populationsdichte im Wirt abhängt (Brunsdon, 1971; Michel, 1969). Steigende Produktion von Eiern einiger überlebender Würmer (Kanobana et al., 2001) kann zu einer Überschätzung der Anthelmnithika-Resistenz führen. Auf der anderen Seite verursachen Makrozyklische Laktone eine transiente Suppression der Eiablage weiblicher Würmer (Le Jambre et al., 1995), die eine Unterschätzung der Medikamentenresistenz zur Folge haben können. Außerdem ist die Interpretation der Eizahl im Kot aufgrund gemischter Populationen adulter und immaturer Stadien verschiedener Spezies und schwankender Eiproduktion im Verlauf der Infektion schwierig (Jackson et al., 2006). Der Eizahlredutionstest ist relativ unsensitiv für die tatsächliche Ermittlung von Anthelminthika-Resistenz, insbesondere, wenn der Infektionsdruck so niedrig ist wie in unserer Studie während des warmen und trockenen Sommers 2006. Zudem erlaubt der Test keine präzise Quantifizierung des Ausmaßes der Resistenz, da keine Dosis-Wirkungs-Daten ermittelt werden können. Jedoch erlaubt der Eizahlreduktionstest, sich einen Überblick über die gegenwärtige Situation im Feld zu verschaffen und eröffnet die Möglichkeit, zu den Betrieben, bei denen eine unvollständige Effizienz vermutet wird, für eine weiterführende Untersuchung zurück zu gehen. Im Gegensatz dazu produzieren in vitro Testverfahren für Anthelminthika-Sensitivität quantitative Daten hinsichtlich des Ausmaßes der Resistenz, sind kostengünstig und relativ schnell durchzuführen. Sie sind daher geeignet, detailliertere Informationen über beginnende Resistenz gegen Anthelminthika zu liefern. In parasitischen Nematoden des Schafes wurde gezeigt, daß Parasitenpopulationen mit hoher Resistenz gegen Benzimidazole oder Makrozyklische Laktone in vivo auch im Larvenentwicklungs-Hemmtest weniger empfindlich sind (Gill et al., 1995; Giordan et al., 1988; Hubert and Kerboeuf, 1992; Lacey et al., 1990; Taylor, 1990). Obwohl für gastro-intestinale Nematoden des Schafes einige in vitro Tests verfügbar sind, wurden solche Tests für Rinderparasiten vor dem Start des PARASOL Projektes nicht beschrieben. Für Benzimidazole ist der Larvenschlupf-Hemmtest der am besten geeignete in vitro Test, da er schnell und einfach durchzuführen ist. Für Thiabendazol konnte eine Grenzkonzentration etabliert werden, so daß dieser Test für die Evaluierung des Benzimidazol-Resistenzstatus von Feldpopulationen verwendet werden kann. Innerhalb des PARASOL Projektes haben wir kürzlich ein für gastro-intestinale Nematoden des Schafes entwickeltes Protokoll adaptiert und den Larvenschlupf-Hemmtest für die Rindernematoden Cooperia und Ostertagia mit Thiabendazol standardisiert (von Samson-Himmelstjerna et al., 2009a). In der beschriebenen Feldstudie waren die Benzimidazole auf allen getesteten Betrieben immer noch vollständig wirksam, während für Ivermectin unvollständige Wirksamkeit nachgewiesen wurde. Da die Makrozyklischen Laktone keine ovizide Wirkung haben, kann der Larvenschlupf-Hemmtest nicht angewendet werden, um Resistenzen gegen Ivermectin nachzuweisen. Andere in vitro Tests wie der Larvenentwicklungs-Hemmtest oder der Larvenmigrations-Hemmtest sind für die Durchführung mit Makrozyklischen Laktonen geeignet. Für parasitische Nematoden des Schafes wurde der Larvenentwicklungs-Hemmtest für Benzimidazole und Levamisol standardisiert (Gill et al., 1995) und ist im Handel erhältlich (DrenchRite®). Der DrenchRite® Test ist auch für Pferde evaluiert aber als ungeeignet eingestuft worden (Tandon and Kaplan, 2004). Dieses unterstreicht die Notwendigkeit solche Resistenztests Spezies-spezifisch zu evaluieren. Die hier vorgestellte Arbeit (Demeler et al., eingereicht) beschreibt die Entwicklung und Evaluierung von in vitro Tests für C. oncophora und O. ostertagi um die Effizienz der Medikamente überprüfen zu können. Während der Larvenmigrations-Hemmtests mehr oder weniger unmittelbar für Rinderparasiten adaptiert werden konnte, war der Larvenentwicklungs-Hemmtest komplexer und schwieriger zu standardisieren. Testparameter wie Temperatur, Zusammensetzung des Mediums und Inkubationszeiten müssen strikt eingehalten werden, da beide Parasitenspezies empfindlicher gegenüber deren Veränderungen sind als vergleichbare Schafparasiten. In der vorliegenden Arbeit wurden „standard operating procedures“ für beide in vitro Tests erarbeitet (Demeler et al., akzeptiert). Für das empfindliche C. oncophora Isolat wurden mittlere EC50-Werte für Ivermectin von 3,19 nM und 123 nM im Larvenentwicklungs-Hemmtest bzw. im Larvenmigrations-Hemmtest ermittelt. Die mittleren EC50-Werte für das Ivermectin-resistente Isolat waren signifikant höher mit Resistenzfaktoren von 5,05 im Larvenmigrations-Hemmtest bzw. 5,30 im Larvenentwicklungs-Hemmtest. Zusätzlich zu diesen beiden Tests, welche freilebende Parasitenstadien verwenden, wurde das „Micromotility Meter“ auf seine Verwendbarkeit zur Detektion von Ivermectin-Resistenz in adulten C. oncophora getestet. Der mittlere EC50-Wert für Ivermectin war für beide C. oncophora Isolate ähnlich dem im Larvenentwicklungs-Hemmtest mit 1,68 nM für das empfindliche und 8,17 nM für das resistente Isolat. Dies ergab einen Resistenzfaktor von 6,11. Obwohl ungeeignet für Feldstudien erwies sich die Methode damit als brauchbar, um Resistenz gegen Makrozyklische Laktone zu detektieren. Für das empfindliche O. ostertagi Isolat wurden für Ivermectin mittlere EC50-Werte von 1,64 nM im Larvenentwicklungs-Hemmtest und 404 nM im Larvenmigrations-Hemmtest etabliert. Beide Testsysteme erwiesen sich als robust und zuverlässig. Der Larvenmigrations-Hemmtest ist außerdem mittels Ringtests in sechs verschiedenen Laboratorien standardisiert worden und ergab reproduzierbare Ergebnisse für beide getesteten Spezies (Demeler et al., in Vorbereitung). Die Fähigkeit des Larvenmigrations-Hemmtests, Resistenz gegenüber Ivermectin im Feld zu detektieren ist in einer kürzlich durchgeführten Feldstudie evaluiert worden (Kleinschmidt et al., in Vorbereitung). Um Grenzkonzentrationen für Makrozyklische Laktone, z.B. Ivermectin, zu etablieren sind noch weitere Tests mit resistenten Isolaten beider Spezies nötig. Dieses wird zur Zeit dadurch erschwert, daß resistente Feldpopulationen schwierig zu isolieren und daher nicht zugänglich sind. Zusätzlich zu den in vitro Tests sind molekulare Methoden entwickelt worden, um Resistenz gegenüber Anthelminthika zu identifizieren. Eine Grundvoraussetzung für die Entwicklung solcher Tests ist die Identifizierung und das Verständnis der Resistenzmechanismen auf molekularer Ebene. Während spezifische Resistenzmechanismen bislang nur für Resistenz gegenüber Benzimidazolen beschrieben sind (Prichard, 2001) gab es leider wenig Erfolg bei der Identifizierung solcher Resistenzmechanismen für Makrozyklische Laktone, die zur Entwicklung von molekularen Resistenzmarkern hätten führen können. Zusätzlich zu den spezifischen Mechanismen sind auch unspezifische Mechanismen wie Breitspektrum Detoxifikationssysteme für Xenobiotika mit der Entwicklung von Resistenz in Verbindung gebracht worden. Im Hinblick auf Anthelminthika Resistenz hat sich die Forschung in letzter Zeit vor allem auf P-Glykoproteine und verwandte ABC-Transporter konzentriert (Jones and George, 2005; Prichard and Roulet, 2007; Xu et al., 1998). Unter Verwendung der hier etablierten in vitro Systeme haben wir mögliche Beteiligung von P-Glykoproteinen an der Ivermectin-Resistenz in C. oncophora analysiert. Die Wirkung von Ivermectin auf ein empfindliches und ein Ivermectin-resistentes Isolat wurde in Gegenwart bzw. Abwesenheit von Verapamil, einem potenten P-Glykoprotein Inhibitor, untersucht. In beiden in vitro Tests wurde der EC50-Wert für Ivermectin nach links verschoben, wenn Ivermectin und Verapamil kombiniert wurden. In Gegenwart von Verapamil wurden keine signifikanten Unterschiede in den mittleren EC50-Werten des empfindlichen und des resistenten Isolates detektiert. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Inhibition von P-Glykoproteinaktivität generell die Empfindlichkeit gegenüber Ivermectin erhöht und P-Glykoprotein Aktivität wesentlich zur verminderten Wirkung von Ivermectin auf das resistente Isolat beiträgt. Trotz der zahlreichen Untersuchungen in diesem Arbeitsfeld konnte bisher kein einzelnes P-Glykoprotein für Resistenz verantwortlich gemacht werden. Im Gegensatz zu den Säugetieren ist das P-Glykoprotein Repertoire der Nematoden sehr divers. So sind z.B. 14 funktionelle P-Glykoproteine im Genom von Caenorhabditis elegans kodiert. Der Schafparasit Haemonchus contortus kodiert ebenfalls einige verschiedene P-Glykoproteine und für O. ostertagi wurde kürzlich ein Ortholog von C. elegans Pgp-2 beschrieben (Sangster et al., 1999; Van Zeveren et al., 2007; Xu et al., 1998). Die große Anzahl verschiedener P- Glykoproteine legt nahe, daß die individuellen P-Glykoproteine unterschiedliche aber überlappende Substratspektra haben. Diese machen es schwierig vorauszusagen, welche P-Glykoproteine in die Mechanismen involviert sind, die zu Resistenz gegenüber unterschiedlichen Klassen von Anthelminthika führen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir die ersten vollständigen P-Glykoprotein Sequenzen für C. oncophora und außerdem zwei kleinere Fragmente. Nach der phylogenetischen „maximum likelihood“ Analyse korrespondieren die Sequenzen zu den C. elegans Genen Pgp-2 und Pgp-3, während die Fragmente als ConPgp-12 und ConPgp-16 designiert wurden. Für das Pgp-2 konnte bereits gezeigt werden, daß es eine Rolle in Resistenz gegenüber Makrozyklischen Laktonen in H. contortus spielt (Blackhall et al., 1998; Xu et al., 1998), und es wurde daher für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Erste Vergleiche der Primärsequenz des empfindlichen und des Ivermectin-resistenten C. oncophora Isolates haben keine wesentlichen Sequenzunterschiede ergeben, obwohl einige wenige Einzelbasenaustausche identifiziert wurden. Allerdings korreliert keine dieser polymorphen Positionen mit dem resistenten Phänotyp. Nichts desto trotz werden weitere detaillierte Sequenzanalysen von empfindlichen und Ivermectin-resistenten Isolaten benötigt, um die Selektion bestimmter ConPgp-2 Allele durch Ivermectin-Resistenz vollständig ausschließen zu können. Zumindest in dem hier verwendeten Ivermectin-resistenten Isolat trägt Hochregulierung von ConPgp-2 nicht zur Ivermectin Resistenzentwicklung bei, da die real-time RT-PCR leicht niedrigere ConPgp-2 mRNA Mengen im resistenten Isolat ergab. Allerdings war dies nicht signifikant. Ähnliche Analysen sollten auch mit dem beschriebenen ConPgp-3 sowie mit weiteren noch nicht identifizierten Mitgliedern der P-Glykoprotein Familie durchgeführt werden. Um das vollständige Substratspektrum einzelner P-Glykoproteine zu charakterisieren und ihre mögliche Beteiligung an Entwicklung von Resistenzen gegenüber verschiedenen Klassen von Anthelminthika abschätzen zu können, werden funktionale Expressionsstudien in eukaryotischen Zellen sowie weiterführende Transportstudien benötigt. Der Eizahlreduktionstest wurde in vivo erfolgreich für die Identifizierung resistenter Nematodenpopulationen aus dem Feld verwendet. Für die detaillierte Charakterisierung des Resistenzstatus solcher Feldpopulationen sind die in dieser Studie beschriebenen in vitro Tests gut geeignet, da sie erfolgreich Resistenz gegen Ivermectin in Isolaten von C. oncophora und O. ostertagi detektieren und quantifizieren. Außerdem waren sie für die Analyse einer möglichen Beteiligung von P-Glykoproteinen an Anthelminthika-Resistenz von Rindernematoden verwendbar. Zusammen mit der Charakterisierung der ersten vollständigen Sequenzen von P-Glykoproteinen in C. oncophora liefern die in dieser Studie präsentierten Daten die notwendigen Vorraussetzungen für die zukünftige detaillierte und funktionelle Analyse von Resistenzmechanismen auf physiologischer und molekularer Ebene.



Demeler, Janina: Physiological and molecular comparison of susceptible and anthelmintic-resistant isolates of cattle parasitic nematodes. Hannover 2009. Tierärztliche Hochschule.


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