Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Investigation of antioxidative capacity in bovine seminal plasma

Calisici, Oguz

The first objective of the present study was to establish an assay to measure total antioxidant capacity (TAC) of bovine seminal plasma. In addition, relationships between TAC and other antioxidants in seminal plasma and sperm quality, respectively, were investigated. The second objective of this study was to investigate the effects of feeding alpha-linolenic (ALA) acid on the antioxidative capacity of seminal plasma. In the first part of the study, eight ejaculates were collected twice weekly for 4 weeks from nine mature Holstein-Friesian bulls. Assays to determine levels of TAC, glutahione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) were modified for use in an automated, 96-well microplate reader. Plasma membrane integrity (PMI) and acrosomal damage (AD) were evaluated by flow cytometry in sperm before cryopreservation and in frozen sperm immediately after thawing. The DNA-fragmentation was determined on frozen-thawed sperm using the sperm chromatin structure assay (SCSAÔ). Membrane lipid peroxidation (LPO; oxidation of lipiphilic probe C11-BODIPY581/591) was quantified with and without induction of LPO using t-butyl hydroperoxide (TBHP) before cryopreservation, 0 and 3 h after thawing. For TAC, SOD and GPx, intra-assay coefficients of variation (CV) were 5.0, 3.5 and 6.2 %, respectively, and inter-assay CV were 8.3, 3.6 and 8.3 %. Levels of TAC, SOD and GPx differed among bulls (P < 0.0001), but not among ejaculates within bulls (P > 0.05). There was a negative correlation (r=-0.76; P ≤ 0.05) between SOD and GPx, but there were no (P > 0.05) other relationships between antioxidants. The TAC was negatively correlated with TBHP-LPO at 0 h (r=-0.85; P ≤ 0.01) and there were positive correlations between SOD and LPO at 0 h (r=0.71; P ≤ 0.05) and 3 h (r=0.80; P ≤ 0.05). There were no (P > 0.05) relationships between DFI and antioxidant levels. In the second part of the study, semen was collected from 17 Holstein Friesian bulls for four weeks twice a week. Thereafter, the basal ration of nine bulls (ALA bulls; age: 3.2±1 yrs) was supplemented with 800 g/day coated alpha-linolenic acid and the basal ration of eight bulls (PA bulls; age: 3.7±0.8 yrs) was supplemented with 400 g/day palmitic acid (Bergafat®). Both fat supplementations were fed for 12 weeks. Volume, sperm concentration, and total sperm number of each ejaculate were determined. PMI and AD were evaluated by flow cytometry before cryopreservation and after thawing. Levels of TAC, GPx and SOD were determined in seminal plasma before and after fat supplementation. Fatty acid content in shock frozen sperm samples was determined using gas chromatography before and after fat supplementation. Feeding ALA increased (P < 0.05) the content of docosahexaenoic acid in ALA bulls whereas the DHA content in PA bulls did not (P > 0.05) change. The increase of DHA in ALA bulls had no (P > 0.05) effect on the seminal plasma levels of TAC, GPx and SOD. Before cryopreservation, values of PMI- and AD were not (P > 0.05) affected by the additional feeding of fatty acids, neither by PA nor by ALA. PMI increased and AD decreased after cryopreservation in ALA bulls as well as in PA bulls during the study period (P < 0.005). In summary, a reliable assay for assessment of TAC in bovine seminal plasma was established. The measurement of TAC gave valuable information about the sensivity of sperm against lipid peroxidation of cryopreserved sperm. The feeding of neither saturated nor polyunsaturated fatty acids affected the antioxidant levels in bovine seminal plasma. Both types of fatty acids increased the quality of cryopreserved sperm, although the content of docosahexaenoic acid in sperm membranes increased only in ALA bulls.

Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Test zu etablieren, um die totale antioxidative Kapazität (TAC) im Seminalplasma von Bullen zu bestimmen und zu prüfen, ob ein  Zusammenhang zwischen TAC und anderen Antioxidantien im Seminalplasma und der Spermaqualität besteht. Das zweite Ziel der Studie lag darin, zu überprüfen, ob die Fütterung der mehrfach ungesättigten Fettsäuren die antioxidative Kapazität im Seminalplasma beeinflusst. Für den ersten Teil der Studie wurden von neun Bullen der Rasse Holstein Frisian über 4 Wochen je zweimal wöchentlich Ejakulate gewonnen. Die Untersuchungsmethoden von TAC, Glutathion-Peroxidase (GPx) und Superoxid-Dismutase (SOD) wurden für den Gebrauch in einem automatischen 96-Well-Mikroplatten-Reader modifiziert. Die Plasmamembranintegrität (PMI) und die akrosomale Schädigung (AD) von frisch verdünntem und kryokonserviertem Sperma wurden mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Bestimmung der DNA-Fragmentierung erfolgte an kryokonserviertem Sperma mit Hilfe des Sperm-Chromatin-Struktur Assays (SCSA™). Die Membranlipidperoxidation (LPO) wurde mit und ohne Induktion der LPO durch tertiäres Butylhydroperoxid (TBHP) vor der Kryokonservierung, unmittelbar (0h) und 3 Stunden (3h) nach dem Auftauen quantifiziert. Für die Bestimmungen von TAC, SOD und GPx lagen die Intra-Assay-Variations-koeffizienten (CV) bei 5,0, 3,5 und 6,2 % und die Inter-Assay-Variationskoeffizienten (CV) bei 8,3, 3,6 und 8,3 %. Der Gehalt von TAC, SOD und GPx unterschied sich zwischen den Bullen (P < 0,0001) aber es bestanden keine (P > 0,05) Unterschiede zwischen den einzelnen Ejakulaten. SOD und GPx korrelierten negativ (r=-0,76; P ≤ 0,05) miteinander. Es waren  keine (P > 0,05) Zusammenhänge zwischen den anderen Antioxidantien festzustellen. Eine negative Korrelation gab es zwischen TAC und TBHP-LPO unmittelbar nach dem Auftauen (r=­0,85; P ≤ 0,01). Die SOD-Werte korrelierten positiv mit den unmittelbar (r=0,71; P ≤ 0,05) und 3 Stunden nach dem Auftauen erhobenen LPO-Werten (r=0,80; P ≤ 0,05). Keine (P > 0,05) Zusammenhänge waren zwischen DFI und den Antioxidantien festzustellen. Für den zweiten Teil der Studie wurden zunächst über einen Zeitraum von 4 Wochen 8 Ejakulate von 17 Holstein Frisian Bullen gewonnen. Anschließend wurde der Grundration von 9 Bullen 800 ggecoateter Alpha-Linolensäure (ALA) pro Tag zugesetzt. Die Grundration der 8 Bullen der Kontrollgruppe wurde mit 400 gPalmitinsäure (PO) pro Tag angereichert. Die Fettsupplementation wurden über 12 Wochen durchgeführt. Das Volumen, die Spermienkonzentration und die Gesamtspermienzahl jedes Ejakulates, sowie PMI und AD vor und nach der Kryokonservierung wurden bestimmt. Die Seminalplasmagehalte an TAC, SOD und GPx (vier Wochen lang vor Versuchsbeginn und vier Wochen lang am Ende des Versuches) sowie die Fettsäureanteile in der Spermienmembranen wurden am Anfang (1. Versuchswoche) und nach der Fettsupplementation (12 Wochen nach Versuchsbeginn) ermittelt. Durch die ALA-Fütterung erhöhte sich der Anteil von DHA (P < 0,05) in der Spermien-membran, während der DHA-Anteil in den Spermien der PA-Bullen gleich blieb (P > 0,05). Der DHA-Anstieg in der ALA-Gruppe hatte keine (P > 0,05) Auswirkungen auf die Antioxidantien (TAC, SOD und GPx). Die vor der Kryokonservierung ermittelten PMI- und AD-Werte änderte sich auch nicht (P > 0,05) durch die Fütterung der beiden Fettsäuren, ALA und PO. Im Gegensatz dazu war nach dem Auftauen bei den Spermien beider Fütterungsgruppen ein Anstieg von PMI und ein Abfall von AD nachweisbar (P < 0,005). Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Arbeit eine verlässliche Methode zur Messung von TAC in bovinem Seminalplasma etabliert. Der TAC-Wert lieferte wichtige Informationen über die Sensibilität von Spermien gegenüber LPO bei der Kryokonservierung. Die Fütterung von gesättigten als auch von mehrfach ungesättigten Fettsäuren hatte zwar keine Auswirkung auf die antioxidative Kapazität in bovinem Seminalplasma, jedoch hatten beide Fettsäuretypen einen positiven Einfluss auf die Spermaqualität.

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Calisici, Oguz: Investigation of antioxidative capacity in bovine seminal plasma. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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