Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen mit dem Verfahren der Bouillon-Mikrodilution bei pathogenen Bakterien von Fischen und molekulare Charakterisierung von Resistenzgenen

Czapiewski, Ellen

During the period 2004-2006, fish-pathogenic bacteria from Germany have been investigated for the first time in the national resistance monitoring program GERM-Vet for their in-vitro susceptibility to antimicrobial agents. In total, 206 isolates, obtained from commercially reared fish and from hobby fish, were included in this study. Susceptibility testing was conducted by broth microdilution according to the recommendations given in the CLSI document M49-A. An incubation temperature of 22 ± 2°C and a panel of 22 antimicrobial agents and two combinations of antimicrobial agents were used. The test population comprised 173 motile Aeromonas spp. isolates, 13 Aeromonas salmonicida isolates and 20 Yersinia ruckeri isolates. While the majority of the Aeromonas spp. isolates originated from hobby fish, isolates of the other groups were obtained from commercially reared fish. Aeromonas spp. isolates (n=44), which have been subjected to further molecular analyses based on their high minimum inhibitory concentrations (MICs) of specific antimicrobial agents, were confirmed for their species assignment by sequence analysis of part of the gyrB gene. These 44 isolates consisted of 19 A. hydrophila isolates [hybridisation group 1 (HG1)], 15 A. veronii biovar sobria isolates (HG8), five A. veronii biovar veronii isolates (HG10), two A. sobria (HG7) and A. bestiarum isolates (HG2) each, as well as a single A. caviae isolate (HG4). For the control of bacterial infections in fish, solely the combination trimethoprim/ sulfamethoxazol (1:19; SXT) has been approved in Germany. High SXT MIC values of >32/608mg/L were seen for 30 Aeromonas spp. isolates and two A. salmonicida isolates. All 32 isolates also carried the sulfonamide resistance gene sul1 as confirmed by PCR. Of them, 27 isolates (25 Aeromonas spp. and the two A. salmonicida isolates) harboured a single class 1 integron while four Aeromonas spp. isolates carried two class 1 integons. Among these class 1 integrons, seven different gene cassettes with the trimethoprim resistance genes dfrA1, dfrA12, dfrA14, dfrA28, dfrB1, dfrB3 or dfrB4 were identified by sequence analysis. PCR analysis confirmed the presence of the trimethoprim resistance gene dfrA1 outside of a class 1 integron in three SXT-resistant Aeromonas spp. isolates. Two of these isolates, however, carried class 1 integrons with other gene cassettes. A total of 12 different gene cassette arrangements were detected: dfrA28-orfV (n=1), dfrA12-orfF (n=1), orf-aadA5 (n=1), dfrB3-aadA1 (n=1), dfrA1-aadA1 (n=4), dfrA14-recombined aadA6 (n=1), catB3-aadA2 (n=3), dfrA12-orfF-aadA2 (n=18), dfrB4-catB3-aadA1 (n=1), dfrB1-aadA1-catB2 (n=2), dfrA12-orfF with integrated IS630-aadA2 (n=1) as well as arr-3-aacA4-blaOXA-10-aadA1 (n=1). High MIC values of other antimicrobial agents were also recorded for some of the isolates tested. Eight Aeromonas spp. isolates showed MIC values of ≥ 64 mg/L for the aminocyclitol antibiotic apramycin. In seven of these eight isolates, the apramycin resistance gene aac(3´)-IV was identified by PCR. Eleven Aeromonas spp. isolates exhibited high chloramphenicol MICs of ≥ 256 mg/L (but low MICs of 1 – 4 mg/L for florfenicol) and harboured a catA2 gene. In contrast, two A. salmonicida isolates with chloramphenicol MICs of 64 mg/L were negative by PCR for the chloramphenicol resistance genes catA1, catA2, catA3, cmlA/cmlB and oqxAB. Another 13 Aeromonas spp. isolates exhibited elevated florfenicol MIC values of 16 – > 64 mg/L and carried the resistance gene floR as confirmed by PCR. Seven of these isolates had an additional catA2 gene and chloramphenicol MIC values of ≥ 128 mg/L. All Aeromonas spp. isolates with tetracycline MIC values of ³ 1 mg/L were tested for the presence of the tetracycline resistance genes tet(A)-(E) and tet(Y). The gene tet(E) was seen most frequently in 64 isolates followed by the gene tet(A) (n=13). The genes tet(C) and tet(D) were identified in three and one isolates, respectively. Some isolates carried two different tet genes: tet(A) + tet(E) in four isolates, tet(C) + tet(E) and tet(D) + tet(E) in two isolates each, as well as tet(C) + tet(Y) in a single isolate. Of the four A. salmonicida isolates with tetracycline MICs of 8 or 16 mg/L, two isolates harboured tet(E), and single isolates tet(A) or tet(C), respectively. This study provided for the first time reliable and comparable data on (a) the susceptibility status of fish-pathogenic bacteria from Germany and (b) genes and associated mechanisms for resistance to selected antimicrobial agents. The association of trimethoprim/sulfonamide resistance with class 1 integrons, which in part carried gene cassettes for other resistance properties, bears the risk of co-selection for other resistance genes under the selective pressure imposed by the use of trimethoprim/sulfonamide combinations.

Im Zeitraum 2004-2006 wurden im Rahmen des Nationalen Resistenzmonitorings GERM-Vet erstmals fischpathogene Bakterien aus Deutschland auf ihre Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen untersucht. Insgesamt wurden 206 Isolate von Nutz- und Zierfischen gesammelt und in die vorliegende Studie einbezogen. Die Empfindlichkeitsprüfung erfolgte mittels Bouillon-Mikrodilution gemäß dem CLSI-Dokument M49-A. Die Isolate wurden bei einer Inkubationstemperatur von 22 ± 2°C auf ihre In-vitro-Empfindlichkeit gegenüber 22 Wirkstoffen und 2 Wirkstoffkombinationen überprüft. Die Untersuchungsgruppe setzte sich aus 173 beweglichen Aeromonas spp.-Isolaten, 13 Aeromonas salmonicida-Isolaten sowie 20 Yersinia ruckeri-Isolaten zusammen. Bis auf die Aeromonas spp., von denen ein Großteil der Isolate aus dem Zierfischbereich stammte, konnten die anderen Spezies bei Nutzfischen isoliert werden. Für 44 Aeromonas spp.-Isolate, die aufgrund auffällig hoher MHK-Werte gegenüber bestimmten Wirkstoffen weiter molekulargenetisch untersucht wurden, erfolgte eine Speziesbestimmung über die Sequenzierung eines Teils des gyrB-Gens. Die 44 Isolate umfassten 19 A. hydrophila-Isolate [Hybridisierungsgruppe 1 (HG1)], 15 A. veronii biovar sobria-Isolate (HG8), fünf A. veronii biovar veronii-Isolate (HG10), je zwei A. sobria- (HG7) und A. bestiarum-Isolate (HG2) sowie ein A. caviae-Isolat (HG4). In Deutschland ist für die Therapie bakterieller Infektionen nur die Wirkstoffkombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol (1:19; SXT) zugelassen. Gegenüber dieser Wirkstoffkombination wiesen 30 Aeromonas spp.- und zwei A. salmonicida-Isolate MHK-Werte von >32/608mg/L auf. Bei allen 32 Isolaten wurde das Sulfonamid-Resistenzgen sul1 durch eine PCR nachgewiesen. Bei 27 Isolaten (25 Aeromonas spp.- und zwei A. salmonicida-Isolate) konnten je ein und bei vier Aeromonas spp.-Isolaten je zwei Klasse 1 Integrons nachgewiesen werden. Innerhalb der Klasse 1 Integrons wurden sieben verschiedene Genkassetten mit den Trimethoprim-Resistenzgenen dfrA1, dfrA12, dfrA14, dfrA28, dfrB1, dfrB3 oder dfrB4 durch Sequenzanalysen bestätigt. Bei drei SXT-resistenten Aeromonas spp.-Isolaten wurde das Trimethoprim-Resistenzgen dfrA1 per PCR außerhalb eines Klasse 1 Integrons nachgewiesen. Zwei dieser Isolate verfügten aber über Klasse 1 Integrons mit anderen Genkassetten. Es wurden insgesamt 12 verschiedene Genkassetten-Arrangements detektiert: dfrA28-orfV (n=1), dfrA12-orfF (n=1), orf-aadA5 (n=1), dfrB3-aadA1 (n=1), dfrA1-aadA1 (n=4), dfrA14-rekombinantes aadA6 (n=1), catB3-aadA2 (n=3), dfrA12-orfF-aadA2 (n=18), dfrB4-catB3-aadA1 (n=1), dfrB1-aadA1-catB2 (n=2), dfrA12-orfF mit integriertem IS630-aadA2 (n=1) sowie arr-3-aacA4-blaOXA-10-aadA1 (n=1). Jedoch konnten auch gegenüber anderen antimikrobiellen Wirkstoffen z. T. hohe MHK-Werte festgestellt werden. Gegenüber dem Aminocyclitol Apramycin zeigten acht Aeromonas spp.-Isolate einen im Vergleich zu den restlichen Isolaten deutlich erhöhten MHK-Wert von ≥ 64 mg/L. Mittels PCR wurde bei sieben der acht Isolate das Apramycin-Resistenzgen aac(3´)-IV nachgewiesen. Elf Aeromonas spp.-Isolate zeigten deutlich erhöhte MHK-Werte von ≥ 256 mg/L gegenüber Chloramphenicol (aber niedrige MHK-Werte von 1 – 4 mg/L gegenüber Florfenicol) und verfügten über ein catA2-Gen; zwei A. salmonicida-Isolate mit MHK-Werten von 64 mg/L waren hingegen negativ in der PCR für die Resistenzgene catA1, catA2, catA3, cmlA/cmlB und oqxAB. Weitere 13 Aeromonas spp.-Isolate wiesen erhöhte MHK-Werte von 16 bis > 64 mg/L für Florfenicol auf. Bei allen Isolaten wurde das Resistenzgen floR mittels PCR nachgewiesen. Sieben dieser Isolate besaßen das Resistenzgen catA2 und zeigten MHK-Werte für Chloramphenicol von ≥ 128mg/L. In die Untersuchung auf die Tetracyclin-Resistenzgene tet(A)-(E) und tet(Y) wurden alle Aeromonas spp.-Isolate mit MHK-Werten für Tetracyclin von ³ 1 mg/L aufgenommen. Am häufigsten wurde das Resistenzgen tet(E) (n=64) nachgewiesen. Das Resistenzgen tet(A) wurde bei 13 Isolaten gefunden. Weiterhin konnte tet(C) bei drei Isolaten und tet(D) bei einem Isolat detektiert werden. Bei einigen Isolaten wurden zwei tet-Gene nachgewiesen: tet(A) + (E) bei vier Isolaten, tet(C) + (E) und tet(D) + (E) bei zwei Isolaten sowie tet(C) + (Y) bei einem Isolat. Von den vier untersuchten A. salmonicida-Isolaten mit MHK-Werten von 8 oder 16 mg/L besaßen zwei Isolate das Resistenzgen tet(E), ein Isolat das Resistenzgen tet(A) und ein Isolat das Resistenzgen tet(C). Mit dieser Arbeit liegen jetzt erstmals objektive und vergleichbare Daten über die In-vitro-Empfindlichkeit pathogener Bakterien von Fischen in Deutschland sowie über die Resistenzgene und Resistenzmechanismen gegenüber ausgewählten antimikrobiellen Wirkstoffen vor. Die Assoziation von Sulfonamid/Trimethoprim-Resistenz mit Klasse 1 Integrons, die zum Teil auch Genkassetten für andere Resistenzeigenschaften tragen, birgt die Gefahr der Co-Selektion anderer Resistenzeigenschaften beim Einsatz von Sulfonamid/Trimethoprim-Kombinationen.

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Czapiewski, Ellen: Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen mit dem Verfahren der Bouillon-Mikrodilution bei pathogenen Bakterien von Fischen und molekulare Charakterisierung von Resistenzgenen. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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