Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Prostaglandin E2-beeinflussten Differenzierung boviner Monozyten in Makrophagen

Düvel, Anna

Since mastitis is the consequence of a galactogen infection it was asked whether the teat as the distal compartment of the udder is mainly involved in the course of the infection, and whether this region is a prominent checkpoint for adaptive and innate immune mechanisms affecting the inflammatory process in the udder parenchyma. Since these mechanisms are initiated and regulated by immune cells and since a deeper analysis of teat- resident leukocytic cells is lacking, the presence and distribution of cells, especially macrophages, in the teat was histologically analysed. Mast cells, neutrophilic granulocytes, lymphocytes, plasma cells and macrophages could be demonstrated in different relative frequencies in subepithelial and perivascular tissue of the Fürstenberg’s rosette and the teat cistern in teats of healthy heifers and lactating cows. Regarding all leukocyte subpopulations, heifers showed the highest relative frequencies. Compared to healthy lactating cows, experimentally E. coli infected animals (72 h or 240 h after intra-cisternal LPS application) did not show a different distribution or a different pattern of teat resident immune cell populations except for cows infected with E. coli 240 hours after LPS application where more neutrophils showed up in the tissue. In summary, it seems that the onset of lactation rather than the more frequent contact with pathogens is the reason for a changed, in general reduced occurrence of immune cells in the teat tissue. In all analyzed animals macrophages could be detected in the Fürstenberg’s Rosette as well as in the teat cistern. Mainly in adult lactating animals, they were present in equal frequency in the Fürstenberg’s rosette and the teat cistern. In order to find evidence for functionally different macrophage types in healthy lactating cows, immunohistology was performed with antibodies specific for S100A8/A9 (MAC387, indicating classical macrophages) and specific for CD163 (mAb AM-3K, indicator for alternative macrophages). Staining of sequential sections allowed for the detection of MAC387+/AM3-K-, MAC387-/AM-3K+ as well as MAC387+/AM-3K+ macrophages. In subepithelial tissue (Fürstenberg’s Rosette), more MAC387+/AM3-K- macrophages were detectable, while MAC387-/AM-3K+ were predominant in perivascular tissue. In the teat cistern, both populations showed an equal perivascular and subepithelial distribution. The phenotypic macrophage heterogeneity suggested that host factors may be significantly involved in the differentiation of immigrating monocytes to macrophages. A transcriptome analysis of teat tissue, 4 h after experimental inoculation of the udder with E. coli, the cyclooxygenase-2 (COX2) revealed as the strongest regulated enzyme of the arachidonic acid metabolism pathway. Therefore, prostaglandin E2 was chosen as a host factor in order to analyze its role in the in vitro differentiation of macrophages. Bovine blood monocytes were separated by MACS and differentiated in the presence of PGE2 (1x10-12 - 1x10-6 mol/l) (PGE2-MdM) or absence of PGE2 (MdM) for seven days to macrophages. In unstimulated and LPS-stimulated cells the mRNA-expression of chemokines (CXCL8, CCL20, CCL5), Cytokines (IL-1β, TNF-α, IL-10, IL-12), the transcription factor PPARγ and the long pentraxin 3 (PTX3) was quantified by real time PCR. MdM showed a base line expression of IL-10, CCL5, CXCL8 and PPARγ. PGE2-MdM (1x10-6 mol/l) showed a significantly lower expression of IL-10, and PPARγ. The LPS stimulation resulted in a significant upregulation of all tested genes, except for IL-12. PGE2-MdM showed a significantly reduced augmentation of the mRNA expression of IL-10, IL-1ß, TNF-α, CCL5, CCL20 and PTX3. Interestingly, the expression of CXCL8 was not influenced in PGE2-MdM. These results show that the endogenous host factor PGE2 affects the expression of pro- and anti-inflammatory molecules of macrophages and that in vitro PGE2 can contribute to the functional polarization of macrophages. PGE2-MdM are similar to so-called inhibited macrophages. Since the expression of PPARγ and its dependent regulated gene PTX3 was down regulated also, it is not likely that PGE2MdM are mainly regulatory, anti-inflammatory macrophages. To test whether PGE2 supports the differentiation of a special macrophage phenotype, the expression of S100A8/A9 and CD163 was analyzed by immunofluorescence where 80% of the macrophages expressed S100A8/A9 (MAC387+) and 40% expressed CD163 (AM-3K+). High and low stained cells could be clearly discriminated. Thus, the in vitro generated macrophages turned out to be phenotypically heterogeneous. In PGE2-MdM, only 23% MAC387+ and 16% AM-3K+ cells were detectable. The relation between MAC387High and AM-3KHigh MdM was 1.9. PGE2-MdM showed a relation of 3.7. This showed that PGE2, if present during the differentiation of macrophages, not only has inhibitory but also selective effects on gene and product expression in macrophages. It could be demonstrated that this mediator, which is produced by different cells after contact with pathogens, is able to control the differentiation of monocytes to different macrophage phenotypes. The possibility to control the differentiation of macrophages with selected factors in a well-directed way is supposed to be the basis for a prophylactic immune modulation regime in cows. The aim is to prepare the teat in a way that functionally adequate macrophages are present when bacteria are invading the udder.

Da sich Mastitiden nach einer galaktogenen Infektion entwickeln, stellt sich die Frage, inwieweit die Zitze als distales Kompartiment des Euters am Infektionsgeschehen maßgeblich beteiligt ist und ob bereits dort die Weichen für adaptive und angeborene Immunmechanismen gestellt werden, die auch im Euterparenchym das entzündliche Geschehen beeinflussen. Da diese Mechanismen von Immunzellen initiiert und mit gesteuert werden und eine genauere Analyse des leukozytärer Zellen in der Zitze bisher nicht vorlag, wurde anatomisch-histologisch das Vorkommen und die Verteilung leukozytärer Zellen, insbesondere Makrophagen, in der Zitze geprüft. In der Zitze gesunder Färsen und laktierender Kühe konnten Mastzellen, neutrophile Granulozyten, Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen in unterschiedlichen relativen Häufigkeiten im subepithelialen und perivaskulären Gewebe der Fürstenberg’schen Rosette und Zitzenzisterne erfasst und dargestellt werden. Färsen wiesen gegenüber laktierenden Tieren generell die größte Häufigkeit von allen identifizierten Leukozytensubpopulationen auf. Experimentell mit LPS vorbehandelte und 72 Stunden oder 240 Stunden danach mit E. coli infizierte Tiere zeigten kein apparent anderes Verteilungsmuster und keine veränderte relative Häufigkeit der Immunzellpopulationen als gesunde laktierende Kühe. Makrophagen wurden bei allen untersuchten Tieren sowohl in der Fürstenberg’schen Rosette, als auch in der Zitzenzisterne nachgewiesen. Sie konnten vor allem in der Gruppe der adulten, laktierenden Tiere, in gleicher Häufigkeit in der Fürstenberg’schen Rosette und Zitzenzisterne dargestellt werden. Mittels Antikörpern gegen S100A8/A9 (MAC387) und CD163 (AM-3K) gelangen der Nachweis und die Quantifizierung funktionell unterschiedlicher Makrophagentypen bei gesunden, laktierenden Kühen. Die phänotypische Heterogenität der Makrophagen ließ vermuten, dass Wirtsfaktoren maßgeblich an der Differenzierung der einwandernden Monozyten in Makrophagen beteiligt sind. Prostaglandin E2 wurde als Wirtsfaktor ausgewählt, um dessen Rolle in der Makrophagendifferenzierung in vitro zu analysieren. Bovine Blut-Monozyten wurden für 7 Tage in Abwesenheit (MdM) oder unter Zusatz von PGE2 (1x10-12 - 1x10-6 mol/l) (PGE2-MdM) in Makrophagen differenziert und mittels quantitativer RT-PCR vor und nach 3-stündiger LPS-Stimulation die mRNA-Expression ausgewählter Zytokine, Chemokine sowie des Transkriptionsfaktors PPARγ und des Pentraxin-3 erfasst. PGE2-MdM erwiesen sich eher als inhibierte Makrophagen. Mittels Immunfluoreszenz wurde die Expression von S100A8/A9 und CD163 in MdM und PGE2-MdM nachgewiesen. Die in vitro generierten MdM exprimierten zu etwa 80% das S100A8/A9 (MAC387+) und zu 40% das CD163 (AM-3K+), wobei jeweils klar differenzierbar stark und schwach-positive Zellen identifiziert werden konnten. Damit erwiesen sich die in vitro generierten MdM als phänotypisch heterogen. In PGE2–MdM waren nur noch 23% MAC387+ und 16% AM-3K+ Zellen nachweisbar. In MdM konnte ein Verhältnis von 1,9 zwischen den stark positiven Zellen (MAC387/AM-3K) ermittelt werden, in PGE2-MdM lag das Verhältnis bei 3,7. Damit zeigte das während der Makrophagendifferenzierung in vitro anwesende PGE2 nicht nur hemmende, sondern auch selektive Effekte auf die Gen- und Produktexpression in Makrophagen, und es konnte gezeigt werden, dass dieser Wirtsfaktor, der nach Erregerkontakt von verschiedenen Zellen gebildet wird, die Differenzierung boviner Monozyten in funktionelle Makrophagen unterschiedlichen Phänotyps steuern kann. Die Möglichkeit, die Differenzierung von Makrophagen durch bestimmte Faktoren gezielt zu steuern, soll mittelfristig die Grundlagen für eine prophylaktische Immunmodulation beim Rind schaffen, in der die Zitze, als erster Ort des Kontaktes mit Erregern so vorbereitet wird, dass funktionell ‚passende‘ Makrophagen als mitentscheidende Sensor- und Effektorzellen adäquat reagieren können.

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Düvel, Anna: Untersuchungen zur Prostaglandin E2-beeinflussten Differenzierung boviner Monozyten in Makrophagen. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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