Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Transgene Expression durch zytoplasmatische Injektion von Plasmiden und Transposon-basierten Konstrukten in Säugerembryonen

Garrels, Wiebke

In the first part of this study circular expression plasmids for the RNA component (hTERC) of human telomerase, and both genes encoding for the telomerase holo-enzyme (hTERC and mhTERT), respectively, were injected into the cytoplasm of in vitro produced bovine zygotes. The injection of covalently closed circular (ccc) plasmids typically leads to transient transgenesis and was used here to study the effects of ectopic expression of human telomerase components in bovine blastocysts. In the second part of the study the focus was to resolve the limitations of transient transgene expression by combining the cytoplasmic plasmid injection with an autonomous transposon system. The following results were achieved: 1.    The human TERC component was ectopically expressed in bovine blastocysts. This led to a significant elongation of telomeres compared to the non-injected controls. The activity of the telomerase was measured and an increase in telomerase activity was observed. 2.    The human telomerase holoenzyme could be reliable expressed through plasmid-based injection of hTERC and mhTERT in bovine blastocysts. This  lead to significant elongation of the telomeres compared to the non-injected culture controls; the telomerase activity was slightly enhanced. No further elongation was achieved through the combined expression when compared to the hTERC group. 3.    The combination of cytoplasmic plasmid injection and non-autonomous SB100 transposon resulted in transgenic mice. The transgene (Venus-transposon) was integrated as a single copy into the genome, germline transmission was confirmed and a transgenic mouse line was established, which could be maintained as a homozygous mouse line. The expression pattern was in accordance with the tissue specificity of the CAGGS promoter and no variegated expression or gene silencing was observed. Interestingly, a distinct allel-dose-effect was detected. Bi-allelic expression of the transgene was observed in all homozygous mice (2 alleles of the transgene). This led to a higher expression compared to heterozygous/hemizygous mice (1 allele of the transgene) and the presence of a larger amount of protein in the homozygous mice. 4.     The combination of cytoplasmic DNA-injection and transposon plasmids was  successfully applied for the production of transgenic pigs and the first transposon-transgenic pigs were produced. The transgenic boars are now 6 months old and will be used to study germline transmission of the transgene by breeding, when the animals reach sexual maturity.

Im ersten Teil der Arbeit wurden zirkuläre Expressionsplasmide für die RNA-Komponente (hTERC) der humanen Telomerase und beide Telomerase-Gene (hTERT und hTERC) in das Zytoplasma in vitro produzierter Rinderzygoten injiziert. Bei den Plasmiden handelte es sich um zirkuläre, kovalent geschlossene (ccc)-Plasmide, die in der Regel eine transiente Transgenese induzieren. Mit der Injektion sollten die Auswirkungen einer ektopischen Expression der humanen Telomerase-komponenten in bovinen Blastozysten untersucht werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Limitierung der transienten Transgenese überwunden werden, indem die zytoplasmatische Plasmidinjektion mit einem nicht autonomen Transposon-System kombiniert wurde. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1.     Die humane TERC Komponente konnte in bovinen Blastozystenstadien ektopisch exprimiert werden. Dies führte zu einer signifikanten Verlängerung der Telomeren im Vergleich zu nicht injizierten Kulturkontrollen. Die Aktivität der Telomerase war erhöht. 2.    Das humane Telomerase-Holoenzym konnte durch Plasmidinjektion von hTERC und mhTERT in bovinen Blastozysten exprimiert werden. Auch dies führte zu einer signifikanten Verlängerung der Telomeren im Vergleich zu nicht injizierten Kulturkontrollen. Die Aktivität der Telomerase war erhöht. Es ergab sich keine weitere Verlängerung im Vergleich zur alleinigen Expression des humanen TERC. 3.    Im zweiten Teil der Arbeit wurden mit Hilfe der Kombination aus zytoplasmatischer Plasmidinjektion und dem nicht autonomen Transposon-System SB100 stabil-transgene Mäuse generiert. Das Transgen (Venus-Transposon) war durch spezifische Transposition als Einzelkopie in das Genom integriert worden; es war keimbahngängig und eine transgene Mäuselinie konnte etabliert werden, diese ist auch als homozygote Linie gezüchtet worden. Das Expressionsmuster war ubiquitär entsprechend der Aktivität des CAGGS-Promoters. Lediglich in der Milz und den roten Blutzellen war keine Expression nachweisbar. Eine variegierende Expression oder Gen-Silencing wurde nicht beobachtet. Interessanterweise war ein eindeutiger Allel-Dosis-Effekt nachweisbar, alle homozygoten Mäuse (2 Transgen-Allele) zeigten eine höhere Expression als heterozyogote/hemizygote Mäuse (1 Transgen-Allel). Beide Allele wurden exprimiert und trugen zur Erhöhung des Proteingehalts des Transgens bei. 4.    Die Kombination aus zytoplasmatischer DNA-Injektion und Transposon-Plasmiden wurde erfolgreich für die Transgenese beim Schwein eingesetzt.  Hier wurden mit hoher Effizienz die ersten Transposon-transgenen Schweine erzeugt. Die positiven Eber sind mittlerweile ein halbes Jahr alt und sollen verpaart werden, um auch beim Schwein die Keimbahntransmission zu verifizieren.

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Garrels, Wiebke: Transgene Expression durch zytoplasmatische Injektion von Plasmiden und Transposon-basierten Konstrukten in Säugerembryonen. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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