Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Fine mapping of quantitative trait loci (QTL) for osteochondrosis in Hanoverian warmblood horses

Komm, Karina

Previous genome and chromosome scans revealed quantitative trait loci (QTL) for osteochondrosis (OC) in Hanoverian warmblood horses on equine chromosomes (ECA) 2, 4, 5, 16, 18 and 21. The subject of this study was to refine detected QTL on ECA2 and 4 in order to identify potential candidate genes involved in the etiopathogenesis of OC. The release of the horse genome assembly EquCab2 enabled the development of new microsatellites which decreased the marker distance of less than 1 Mb in significant regions. 104 Hanoverian warmblood horses of 14 paternal half-sib families, their dams and 8 sires were genotyped. Linkage and association analyses were performed for six phenotypic traits: (1) OC (fetlock and/or hock joints), (2) OCD (fetlock and/or hock joints), (3) fetlock OC, (4) fetlock OCD, (5) hock OC, and (6) hock OCD. On ECA2, altogether 37 newly developed microsatellites and 24 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) were genotyped. The QTL for the different traits of OC could be confirmed and narrowed down: for OC to an interval at 20.08 to 30.94 Mb, for OCD at 26.89 to 29.47 Mb, for fetlock OC at 15.65 to 30.94 Mb, for fetlock OCD at 21.15 to 31.91 Mb, and for hock OC between 26.89 to 33.05 Mb. On ECA4, a total of 41 microsatellites and 11 SNPs were newly developed and used for linkage and association analyses. The QTL for OC could be delimited between 4.92 and 39.76 Mb, the fetlock OC QTL could be narrowed down to an interval at 7.42 to 13.10 Mb, at 27.15 and 28.79 Mb and at 56.15 to 59.84 Mb. Furthermore, a QTL for hock OC could be detected between 3.62 and 6.34 Mb. The further aim of this study was to approve identified QTL of previous studies and to detect new potential QTL by performing a whole genome scan with SNPs using the equine SNP50 BeadChip. This comprehensive and powerful microarray allows genotyping of more than 50,000 SNPs simoultaneously. The whole genome association analysis was performed with 154 unrelated Hanoverian warmblood horses, 39 of them already genotyped in the genome scan. Regarding detected QTL on chromosomes 2, 4, 5, 16, 18 and 21, a total of 313 significant associated SNPs for the six different phenotypic traits of OC were observed. Multiple variance analysis was performed in order to focus on meaningful associated SNPs. The QTL on ECA2 could be confirmed at 17.55 Mb and was therefore consistent with results of genome scan and fine mapping studies (15.65 - 33.05 Mb all phenotypic traits). On ECA4, variance analysis revealed two QTL at 7.61 Mb and additionally at 39.26 Mb which were located within the QTL of previous linkage studies as well. Furthermore, a total of ten QTL on ECA3, 5, 7, 16, 19, 20, 22, 26, and 29 were detected. The whole genome scan and adjacent fine mapping studies were the first steps towards the identification of significant regions harbouring potential candidate genes which might be involved in the development of OC. The equine BeadChip implied a great progress in molecular genetic research and permitted the verification of identified QTL on ECA2 and 4. Furthermore, this microarray enabled the detection of new potential QTL previously unknown. Following studies have to approve current results of the BeadChip in a large sample of horses. The use of the next generation of equine microarray technologies with a much denser marker set could be helpful to clarify the relevance of numerous associated SNPs. Furthermore, mutation and expression analyses of detected potential candidate genes nearby identified QTL should be performed.

Vorangegangene Genom- und Chromosomscans deckten merkmalsbeeinflussende Genorte (quantitative trait loci, QTL) für Osteochondrose beim Hannoveraner Warmblutpferd auf den Chromosomen 2, 4, 5, 16, 18 und 21 auf. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Feinkartierung von den Pferdechromosomen (ECA) 2 und 4 durch eine Erhöhung der Markerdichte. Somit sollten potentielle Kandidatengene aufgedeckt werden, die möglicher Weise an der Entstehung der Osteochondrose (OC) beteiligt sind. Die Veröffentlichung des Pferdegenoms EquCab2 machte die Entwicklung neuer Mikrosatelliten möglich, wodurch eine Markerdichte in den signifikanten Bereichen auf ECA 2 und 4 von unter einer Megabase erzielt werden konnte. Diese Mikrosatelliten wurden an 14 väterlichen Halbgeschwisterfamilien genotypisiert, welche sich aus 104 Fohlen, 99 Müttern und acht Hengsten zusammensetzten. Eine nicht-parametrische Kopplungsanalyse wurde unter Verwendung der Software MERLIN durchgeführt und basierte auf dem „identical-by-descent“ (IBD) Verfahren. Kopplungs- und Assoziationsanalysen wurden für die sechs Merkmale OC, OCD, OC im Fesselgelenk (OCF), OCD im Fesselgelenk (OCDF), OC im Sprunggelenk (OCH) und OCD im Sprunggelenk (OCDH) getrennt durchgeführt. Auf ECA2 wurden insgesamt 37 neu entwickelte Mikrosatelliten und 24 Einzelbasenaustausche (Single Nucleotide Polymorphism, SNPs) genotypisiert. Der QTL für OC wurde zwischen 20.08 und 30.94 Mb, für OCD zwischen 26.89 und 29.47 Mb, für OCF zwischen 15.65 und 30.94 Mb, für OCDF zwischen 21.15 und 31.91 Mb und für OCH zwischen 26.89 und 33.05 Mb eingegrenzt. Für die Kopplungs- und Assoziationsstudie auf ECA4 wurden insgesamt 41 Mikrosatelliten und 11 SNPs neu entwickelt und analysiert. Der QTL für OC wurde zwischen 4.92 und 39.76 Mb, für Fesselgelenks-OC zwischen 7.42 und 13.10 Mb, bei 27.15 und 28.79 Mb sowie zwischen 56.15 und 59.84 Mb identifiziert. Außerdem konnte ein QTL für das Merkmal OCH in einem Intervall von 3.62 and 6.24 Mb aufgedeckt werden. Als weiteres Ziel dieser Arbeit galt die Eingrenzung neuer, bisher unbekannter OC-QTL durch eine genomweite Assoziationsanalyse mit SNPs. Mit Hilfe des seit 2008 kommerziell erhältlichem SNP-Chips wurden ~50.000 SNPs in einem Arbeitsschritt durch ein automatisiertes Verfahren an 154 unverwandten Hannoverschen Warmblutpferden genotypisiert. 39 dieser Pferde wurden bereits im vorangegangenen Genomscan analysiert. Auf verschiedenen Chromosomen wurde eine große Anzahl assoziierter SNPs gefunden, unter anderem auf ECA2 und 4. In der folgenden Varianzanalyse wurden SNPs mit einer genomweiten Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≥ 2.5 (-log10P) berücksichtigt. Es konnten 13 QTL auf 11 verschiedenen Chromosomen, darunter ECA2 und 4 aufgedeckt werden, die insgesamt eine phänotypische Varianz von 43.54% erklärten. Der QTL auf Chromosom 2 wurde bei 17.55 Mb lokalisiert und erklärt allein eine phänotypische Varianz von 4.02%. Auf ECA4 wurden zwei QTL aufgedeckt. Der Erste bei 7.61 Mb erklärte eine phänotypische Varianz von 6.35%, und ein Weiterer bei 39.26 Mb erklärte 3.02%. Außerdem konnten auf den Chromosomen 3, 5, 7, 16, 19, 20, 22, 26 und 29 neue QTL identifiziert und somit nach neuen potentiellen Kandidatengenen gesucht werden. Dazu wurden die neu identifizierten Bereiche nach Genen, die im Zusammenhang mit dem Komplex der Osteochondrose stehen könnten durchsucht. Auf ECA2 und 4 konnten insgesamt elf funktionelle Kandidatengene aufgedeckt werden, die direkt oder indirekt am Knorpel- und Knochenstoffwechsel beteiligt sind. Mit dem neuerdings erhältlichen SNP-Chip bietet sich für das Pferd eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, genomweite Analysen mit enorm hoher Auflösung durchzuführen. Es ist nicht davon auszugehen, dass es sich bei der Vielzahl der assoziierten SNPs um kausale Mutationen handelt, da der Großteil der Marker lediglich intergenisch lokalisiert ist. Der vorangegangene Genomscan und anschließende Feinkartierungsstudien stellen somit trotz neuester Microarry-Technologien weiterhin wichtige Voraussetzungen für eine erfolgreiche Suche nach funktionellen und positionellen Kandidatengenen dar. Um den Schritt von assoziierten Markern zur Identifizierung kausaler Mutationen gehen zu können, sind weitere Studien nötig. Zum Einen Studien mit erweitertem Pferdematerial beziehungsweise weiterer Rassen und zum Anderen genomweite Assoziationsanalysen mit Hilfe einer neuen Generation des SNP-Chips mit noch höherer Auflösung.

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Komm, Karina: Fine mapping of quantitative trait loci (QTL) for osteochondrosis in Hanoverian warmblood horses. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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