Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Ermittlung der Absterbekinetik von Bacillus cereus-Sporen gegenüber einem Peressigsäurepräparat

Sudhaus, Nadine

Bacillus cereus is a highly underestimated food associated pathogen. B. cereus associated intoxications often occur with mild symptoms and persist for a short period of time. Therefore many cases are not reported to national authorities. The estimated number of unreported cases might be very high, which leads to underestimation of the safety hazard caused by this agent. Dust and soil are possible vehicles for B. cereus to enter the food chain. Insufficient cleaning and disinfection can lead to the cross contamination of all foods treated in the kitchen. Spore-forming bacteria like B. cereus are able to survive almost all physical (e. g. heating) or chemical treatments (e. g. disinfection) that are routinely performed to inactivate hazardous microorganisms. Furthermore, heating procedures may initiate spore germination. Without a competitive flora B. cereus can proliferate very fast. Hence it is very important to store the food at proper temperatures (above 65 °C) or cool it down fast enough. Otherwise B. cereus might proliferate and produce toxins and hence be a hazard to the consumer. Cleaning and disinfection of surfaces must be optimized in order to avoid this hazard. Beside vegetative forms, spores must also be regarded in disinfection procedures. Accurate microbial death models are of considerable help to the food industry for the development of effective disinfection regimes. This will in turn lead to safer foods with improved quality and shelf life. Therefore, the prime objective of this study was to produce accurate predictive models for the reduction of B. cereus spores which can be achieved during treatment with a disinfectant. Furthermore, the influence of environmental conditions was also evaluated. Peracetic acid is known to be sporicidal and was therefore used in this study. The efficacy of the commercial peracetic acid disinfectant PES 15/23 against spores of B. cereus was confirmed. It was applied in standard concentrations of 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 %. The factors protein load and temperature were identified and measured by testing at three temperatures (10, 15 and 20 °C) and in presence and absence of protein respective. A qualitative suspension test, a quantitative suspension test and a neutralization test were carried out to evaluate the nature of inactivation kinetics. This procedure ensured reliable results without method-depending variances. Spores of four different strains of B. cereus were tested. The strains DSM 4312 (emetic type), DSM 4313 and DSM 4384 (both diarrhoeal type) were toxin-producing strains isolated from food borne diseases, the strain DSM 318 was isolated from soil. Those strains were chosen in order to have the ability to compare different toxinogenic types with each other and with a strain from the environment. Temperature showed a significant effect on treatment effectiveness indicating that, for all strains, reductions in the number of survivors were highest when PES 15/23 was applied at the temperature of 20 ºC. The effect of PES 15/23 diminished when the temperature decreased to 10 ºC. The loss of efficacy at low temperatures could be compensated with higher concentrations or a longer contact time. The protein load did not significantly reduce the efficacy of the disinfectant. Low protein load usually occurs on rough surfaces in the kitchen. This study showed that those low residues did not have a considerable influence on the efficacy of peracetic acid. The diarrhoeal strain DSM 4313 was more resistant to PES 15/23 than the other strains in this study. Thus the diarrhoeal strain should be considered as the target in the design of proper disinfection procedures using peracetic acid. All three tests led to comparable results. The observed inactivation kinetics displayed tails and in some cases a shoulder. This nonlinear behaviour proved true in all concentrations and temperatures tested. Inactivation curves were calculated with the Weibull distribution model. By using this model to analyze the inactivation, good results at the three temperatures studied were achieved. Suspension tests are not able to simulate disinfection in practice, but these models will enable food manufacturers to design more effective and efficient disinfectant procedures that can also cope with bacterial spores.

Bacillus cereus ist ein stark unterschätzter Lebensmittelintoxikationserreger. Er löst häufig milde und zeitlich begrenzte Erkrankungen aus, die von nationalen Statistiken und Meldesysteme nur selten erfasst werden. Es ist hier von einer sehr hohen Dunkelziffer auszugehen, die zu Fehlinterpretationen der Statistiken führen und somit das Risiko des Intoxikationserregers unterbewerten. Der Eintrag in die Lebensmittelkette kann über Kontaminationen mit Staub und Erdbodenpartikeln erfolgen. Bei mangelnder Küchenhygiene kann es dann schnell zu Kreuzkontaminationen anderer Lebensmittel kommen. B. cereus als Sporenbildner überlebt die meisten sich anschließenden lebensmitteltechnologischen Hürden (chemischer u. physikalischer Natur). Dies führt dazu, dass zusätzlich die kompetitive Begleitflora eliminiert wird. Durch Erhitzungsprozesse werden die Sporen zum Auskeimen angeregt. Wenn das fertige Produkt im Anschluss nicht genügend erhitzt (über 65 °C gehalten) und oder nicht schnell genug oder eventuell gar nicht gekühlt wird, kann es zur Vermehrung von B. cereus, zur Bildung von Toxinen und zur Gefährdung des Verbrauchers kommen. Sinnvoll ist es daher die Küchenhygiene, insbesondere Desinfektionsmaßnahmen von Oberflächen, zu optimieren. Dabei sollte nicht nur Bakterizidie (vegetative Formen), sondern auch Sporizidie angestrebt werden. Von großem Nutzen ist es, die Absterbekinetiken der Sporen von B. cereus zu kennen. Grundvoraussetzung zur Ermittlung der Kinetiken ist ein Desinfektionsmittel, das sicher sporizid wirkt. Zum Einsatz kam daher ein handelsübliches Peressigsäurepräparat (PES 15/23) mit sporizider Wirkung in praxisnahen Anwendungskonzentrationen (0,25 %, 0,5 %, 1,0 %, 1,5 % und 2,0 %). Bei der Desinfektion im Küchenbereich müssen Umweltfaktoren, wie eine eventuelle Belastung der Oberflächen (Eiweißrückstände) und niedrige Umgebungstemperaturen, berücksichtigt werden. Daher wurde in dieser Arbeit bei drei verschiedenen Temperaturen (10, 15 und 20 °C) und jeweils mit und ohne Eiweißbelastung getestet. Der qualitative Suspensionstest, der quantitative Suspensionstest sowie der Verdünnungs-Neutralisationstest wurden angewendet. Die drei unterschiedlichen Testarten wurden herangezogen, um die Natur der Absterbekinetiken ohne starke methodenabhängige Schwankungen zu ermitteln. Da eine Vielzahl unterschiedlicher B. cereus-Stämme existiert, die sich in ihrem Toxinbildungsvermögen unterscheiden, wurden für diese Arbeit drei Stämme, die bei Krankheitsausbrüchen (zwei Diarrhoe- und ein Emetik-Toxintyp) isoliert wurden, und ein Erdbodenisolat verwendet. Die ermittelten Absterbekinetik-Kurven zeigten teils konkave teils konvexe Verlaufsformen. Dieses nicht lineare Verhalten bestätigte sich in den verschiedenen Konzentrationen und Temperaturen. Weder der Zusatz des Rinderserums im quantitativen Suspensionstest, noch das Albumin des Verdünnungs-Neutralisationstests, hatten einen signifikanten Einfluss auf die Wirksamkeit der Peressigsäure gegen die Sporen. Demnach sind geringgradige Rückstände von Proteinen, die im Lebensmittelbereich auf rauen Oberflächen teils unvermeidlich sind, kein großes Problem beim Einsatz von PES 15/23. Die Ergebnisse zeigten auch, dass für alle Stämme die Keimreduktion mit PES 15/23 am größten war, wenn die Umgebungstemperatur 20 °C betrug. Die Reduktionen verringerten sich über 15 °C bis hin zu 10 °C drastisch. Besonders wichtig ist es daher, den Wirksamkeitsverlust bei niedrigen Temperaturen zu kompensieren. Da sich jedoch die Inaktivierung mit der Länge der Einwirkungszeit und der Steigerung der Anwendungskonzentration kontinuierlich steigerte, bieten sich dem Anwender mehrere Möglichkeiten, eine erfolgreiche Desinfektion zu gewährleisten. Die Reduktionsstufen in den gleichen Konzentrationsstufen variierten zwischen den Stämmen und Umgebungstemperaturen erheblich. Der Diarrhoe-Stamm DSM 4313 zeigte durchgängig die niedrigsten Reduktionen, gefolgt vom Erdbodenisolat und dem Emetik-Stamm. Der Diarrhoe-Stamm DSM 4384 stellte sich als der Sensibelste heraus. Bei dem besonders resistenten B. cereus-Stamm (DSM 4313) musste demnach eine viel höhere Anwendungskonzentration eingesetzt werden, um eine Wirksamkeit zu erzielen. Die eingesetzten Suspensionstests können zwar nicht die realen Umstände einer Desinfektionsmaßnahme widerspiegeln, liefern aber dennoch entscheidende und ausschlaggebende Informationen zur Prozessoptimierung. Größere methodenabhängige Schwankungen sind bei dieser Studie auszuschließen, da sich die Ergebnisse der verschiedenen Testarten bestätigten. Zur eingangs erwähnten Optimierung von Desinfektionsmaßnahmen gegen Sporen von B. cereus sollte, aufgrund der unterschiedlichen Resistenz der Stämme, immer das Absterbeverhalten des resistentesten Stammes (Diarrhoe-Stamm DSM 4313) zur Orientierung herangezogen werden.

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Sudhaus, Nadine: Ermittlung der Absterbekinetik von Bacillus cereus-Sporen gegenüber einem Peressigsäurepräparat. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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