Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung zur histamin- und serotonininduzierten sowie durch passive Sensibilisierung induzierten Bronchokonstriktion an "Precision Cut Lung Slices" des Pferdes

Wabnitz, Svenja

The aim of this study was to examine the effects of histamine, serotonin, their inhibitors, and the effect of the H4-agonist 4-methylhistamine on equine bronchoconstriction with precision-cut lung slices (PCLS), a technique established by VIETMEIER (2004). Additionally we investigated if the model of passive sensitization established in the rat by WOHLSEN et al. (2001) can be applied to the horse.14 horses were available for this study. A general clinical examination and an examination of the respiratory tract (including arterial blood gas analysis and bronchoscopy followed by analysis of aspirated tracheobronchial secretions) was performed one day before euthanasia. The results obtained were used to divide the horses in groups according to evidence of pulmonary disease. Immediately post mortem the Lobus accessorius was removed through an intercostal approach and filled with 1,5 % agarose solution. PCLS were obtained from the lung tissue using a microtome. Vitality was verified before and after every contraction series with a methacholine-induced (10-5 mol/l) bronchoconstriction. In the first contraction series the concentration of histamine and serotonin was increased after each application on the PCLS, from 10-7 to 10-4 mol/l for histamine and 10-8 to 10-5 mol/l for serotonin. In the second contraction series the effects of histamine receptor antagonists (cetirizin, rantidin, thioperamid, JNJ7777120) and a serotonin receptor antagonist (ketanserin) were tested. This was done by incubating the PCLS with one particular receptor antagonist for 30 minutes. The contraction status of the bronchi was photographed in defined intervals and digitally evaluated using two image analysis. With this method it was possible to evaluate the extent of bronchoconstriction in comparison to the initial lumen. Histamine caused a concentration-dependent bronchoconstriction, which was slightly significant (p=0,05) starting at a concentration of 10-5 mol/l. The histamine induced bronchoconstriction could be inhibited by a previous incubation period with the H1-receptor antagonist cetirizin. However, prior incubation with the antagonists ranitidin, thioperamid and JNJ7777120 showed no significant effects. Serotonin showed a concentration-dependent bronchoconstriction in one of the six horses, which could be inhibited by prior incubation with ketanserin. 4-methylhistamine did not induce bronchoconstriction in any of the vital PCLS. For the passive sensitization the PCLS were incubated in serum from a horse actively sensitized against ovalbumin. As control group serum from a horse with no detectable antibodies against this allergen was used. The response of the bronchi was photographed two and ten minutes after the addition of ovalbumin. While two horses showed no reaction, a considerable constriction could be detected in the PCLS of seven horses in both groups. One horse showed a significant reaction only in the passively sensitized slices. Due to the high number of slices that can be obtained from one lung, the PCLS-technique allows a reduction of the number of experimental animals. In the present study we were able to gain an insight into the basic effects that histamine and serotonin have on the bronchi of horses and the ability of specific receptor antagonists to prevent these effects. There were no clear findings for the passive sensitization of PCLS of the horse. For further studies on a model of passive sensitization an allergen should be used to which the horses have not come into contact under normal conditions.

Ziel der vorliegenden Studie war es, mit Hilfe der von VIETMEIER (2004) etablierten PCLS-Methodik den Effekt von Histamin und Serotonin sowie ihrer Inhibitoren und dem H4-Agonisten 4-Methylhistamin auf die Bronchokonstriktion vom Pferd zu untersuchen. Außerdem wurde getestet, ob sich das von WOHLSEN et al. (2001) bei Ratten etablierte Modell der passiven Sensibilisierung auf das Pferd übertragen lässt. Für die Studie wurden die Lungen von insgesamt 14 Probanden verwendet. Am Tag vor der Euthanasie wurde eine allgemeine und weiterführende klinische Untersuchung (mit Blutgasanalyse und Endoskopie incl. BAL und TBS-Analyse) durchgeführt. Anhand der vorhandenen Befunde wurden die Probanden hinsichtlich der Hinweise auf eine Lungenerkrankung eingeteilt. Unmittelbar nach dem Eintreten des Todes wurde der Lobus accessorius über einen Interkostalschnitt entnommen und mit 1,5 %iger Agarose befüllt. Die Herstellung der PCLS erfolgte mit Hilfe eines Mikrotoms. Eine Vitalitätsprüfung der PCLS erfolgte zu Beginn und am Ende jeder Versuchsreihe anhand einer durch Methacholin induzierten (10-5 mol/l) Bronchokonstriktion. Für Histamin und Serotonin erfolgte eine Kontraktionsreihe, bei der die Substanz akkumulierend zugegeben wurde (10-7 bis 10-4 mol/l bzw. 10-8 bis 10-5 mol/l). In einer zweiten Kontraktionsreihe wurde der Effekt eines Histaminrezeptorantagonisten (Cetirizin, Ranitidin, Thioperamid, JNJ7777120) bzw. eines Serotoninrezeptorantagonisten (Ketanserin) geprüft. Dafür wurden die PCLS für 30 Minuten mit dem jeweiligen Antagonisten (10-5 mol/l) inkubiert. Die Reaktion der Bronchioli wurde nach einem definierten Zeitschema fotografisch festgehalten und mit Hilfe von zwei Bildbearbeitungsprogrammen digital ausgewertet. Dies bot die Möglichkeit, das Ausmaß der Kontraktionsstärke im Vergleich zum Ausgangszustand zu berechnen. Für Histamin konnte eine konzentrationsabhängige Bronchokonstriktion dargestellt werden, die sich ab einer Konzentration von 10-5 mol/l als schwach signifikant (p=0,05) erwies. Diese Bronchokonstriktion wurde durch die vorherige Inkubation mit dem H1-Rezeptorantagonisten Cetirizin gehemmt, während durch die Inkubation mit Ranitidin, Thioperamid und JNJ7777120 kein signifikanter Unterschied zur ersten Konzentrationsreihe (ohne Antagonist) beobachtet werden konnte. Für Serotonin zeigte sich bei einem der sechs Probanden eine konzentrationsabhängige Bronchokonstriktion, die durch eine vorherige Inkubation mit Ketanserin gehemmt werden konnte. Durch die Zugabe von 4-Methylhistamin (10-5 mol/l) ließ sich an keinem der vitalen PCLS eine Bronchokonstriktion induzieren. Bei dem Versuch, die PCLS vom Pferd passiv zu sensibilisieren, wurden diese im Serum eines zuvor gegen Ovalbumin aktiv sensibilisierten Pferdes inkubiert. Für die Kontrollgruppe wurde Serum eines Pferdes verwendet, bei dem keine Antikörper gegen das verwendete Allergen nachgewiesen werden konnten. Die Reaktion der Bronchioli wurde zwei und zehn Minuten nach der Zugabe des Ovalbumins fotografisch festgehalten. Während bei zwei Probanden weder die passiv sensibilisierten noch die Kontrollschnitte eine Reaktion auf die Ovalbuminzugabe zeigten, reagierten bei sieben Probanden sowohl die passiv sensibilisierten als auch die Kontrollschnitte. Nur bei einem Pferd konnte die bei Ratten beobachtete Reaktion, bei der nur die passiv sensibilisierten Schnitte kontrahierten, nachgewiesen werden. Mit Hilfe der PCLS-Methodik kann durch die Vielzahl an Schnitten, die pro Präparat gewonnen werden können, die Anzahl der genutzten Tiere reduziert werden. Die vorliegende Studie bietet die Möglichkeit grundlegende Erkenntnisse zur Wirkung von Histamin und Serotonin sowie zur Antagonisierbarkeit durch den jeweiligen Rezeptorantagonisten zu erlangen. Für den Versuch die PCLS vom Pferd passiv zu sensibilisieren können keine eindeutigen Erkenntnisse erlangt werden. Für das Modell der passiven Sensibilisierung sollte für zukünftige Studien ein Allergen verwendet werden, zu dem die Pferde noch keinen Kontakt gehabt haben.

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Wabnitz, Svenja: Untersuchung zur histamin- und serotonininduzierten sowie durch passive Sensibilisierung induzierten Bronchokonstriktion an "Precision Cut Lung Slices" des Pferdes. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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