The role of sialic acids in avian influenza virus infection of primary cell cultures

Die Infektion durch Influenza-Viren wird eingeleitet durch die Bindung des Hämagglutinins (HA) an Zelloberflächen-Glykoside mit terminalen Sialinsäuren (Sia). Es wird vermutet, dass die Verteilung von α2,3- und α2,6-gebundenen Sia auf den verschiedenen Zelltypen zusammen mit der Präferenz des Virus für diese Rezeptor-Determinante sowohl die Zell- als auch die Spezies-Spezifität des Virus bestimmen. In dieser Studie wurde die Infektion von Trachealring-Kulturen (TOCs) von Huhn und Pute durch aviäre Influenza Viren des H7 und H9 Subtyps charakterisiert. In TOCs bleibt die natürliche Zusammensetzung der Epithelzellen erhalten. Darüber hinaus ist eine Infektion durch ziliostatische Viren, wie Influenza Viren, durch Beobachtung der Zilien-Aktivität einfach zu detektieren. Um die Rolle der Sia beim Entstehen der Infektion zu untersuchen, wurden TOCs vor der Infektion mit Neuraminidase (NA) behandelt, um die Sia von der Zelloberfläche zu entfernen und die Zellen so vor einer Influenza Virus Infektion zu schützen. Der Effekt dieser NA-Vorbehandlung auf die Infektion wurde durch die Beobachtung der Zilienaktivität, sowie durch Immunfärbung von viralem Antigen und die Bestimmung der Menge infektiöser Viren im TOC-Überstand im frühen Verlauf der Infektion untersucht. Zusätzlich wurden die Zilien des Flimmerepithels angefärbt (anti-Tubulin), um mögliche Schädigungen der Epithelzellen sichtbar zu machen. Für die Infektion von Hühner- und Puten-TOCs durch ein H7N7 Virus war ein deutlicher, protektiver Effekt der NA-Vorbehandlung zu beobachten. Dieser Effekt äußerte sich in einer Verzögerung der Virus-induzierten Ziliostase, sowie in einer Reduzierung des detektierten Antigens 24h p.i. und des Titers infektiöser Viren im TOC-Überstand 9h p.i.. Die Tubulin-Färbung dieser TOCs zeigte eine starke Schädigung des Epithels 24h nach der Infektion unbehandelter TOCs, während in NA-vorbehandelten TOCs nur milde Schäden beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu wurde weder durch das Monitoring der Zilienaktivität, noch in der Immunfärbung ein Effekt der NA-Vorbehandlung auf die Infektion von Hühner-TOCs durch ein H9N2-Virus beobachtet. Nur die Titration von TOC-Überständen, die 6h p.i. genommen wurden, zeigte einen gewissen Abfall der Anzahl infektiöser Viren. Die Infektion von Puten-TOCs durch das H9N2 Virus zeigte jedoch in allen angewandten Evaluierungskriterien NA-Sensitivität. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung unterschiedlicher Rezeptoren auf der Wirtszelloberfläche durch aviäre Influenza Viren sowohl vom Virus-Subtyp, als auch von der Wirtsspezies abhängt. Fluoreszenzfärbungen unter Zuhilfenahme spezifischer Lektine zur Detektion von α2,3 und α2,6 gebundenen Sia zeigten, dass sowohl Hühner- als auch Puten-TOCs α2,3 gebundene Sia aufwiesen, während α2,6 gebundene Sia nur auf der Zelloberfläche des respiratorischen Puten-Epithels, nicht aber auf der apikalen Membran von Hühner-TOCs gefunden wurden. Um die Anzahl an Möglichkeiten der Sia-Detektion und –Unterscheidung zu verfeinern, wurden lösliche HA Konstrukte erstellt und deren Bindungseigenschaften charakterisiert. Das Fc-markierte H7Fc Konstrukt zeigte eine NA-sensitive Bindung an MDCK II Zellen und erkannte ebenfalls das apikale Epithel von Hühner-TOCs. Lösliche HAs könnten daher erheblich zur Unterscheidung verschiedener Sia und Sia-Bindungen beitragen und detailliertere Untersuchungen der Rezeptor-Präferenzen verschiedener Influenza-Virus-Stämme ermöglichen. Überdies bilden lösliche HAs ein sicheres Werkzeug, um die Rezeptorbindung hoch pathogener aviärer Influenza Viren ohne die Notwendigkeit eines Hochsicherheitslabors zu analysieren.