Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

The role of sialic acids in avian influenza virus infection of primary cell cultures

Bohm, Maren Gertrud

Infection by influenza viruses is initiated by an entry process that requires the binding of the viral surface protein hemagglutinin (HA) to cell surface glycosides terminating in sialic acids (Sia). The distribution of α2,3 and α2,6-linked Sia on different cell types and the viral preference for either of these receptor determinants is believed to play an important role for the cell and species specificity of the virus. In this study, the infection by avian influenza virus strains of the H7 and H9 subtype was characterized in tracheal organ cultures (TOCs) from chicken and turkey. TOCs preserve the natural arrangement of the epithelial cells, and an infection by ciliostatic viruses, like influenza viruses, can be easily detected by monitoring the ciliary activity with a light microscope. To analyze the role of Sia in the onset of infection, TOCs were pretreated with neuraminidase (NA) to remove Sia from the cell surface. The effect of this NA-pretreatment on the influenza virus infection was analyzed by (i) monitoring the ciliary activity of the TOCs, (ii) detection of infected cells by immunostaining of viral antigen, (iii) staining of the cilia on the surface of the epithelium to visualize potential tissue damage, and (IV) titration of the amount of infectious virus released into the TOC supernatant early post-infection (p.i.). A clear protective effect of the NA-pretreatment was observed on the H7N7 virus infection of both chicken and turkey TOCs. This protective effect was evident by a delayed ciliostasis as well as by a reduction of the number of infectious virus particles released into the TOC supernatant 9h p.i. and of virus antigen detection 24h p.i.. Tubulin staining of these TOCs revealed strong tissue destruction 24h p.i. by the infection of TOCs, but only mild damage when the samples had been pretreated with neuraminidase. By contrast, no protective effect on the infection of chicken TOCs by an H9N2 virus strain was found when infection was evaluated by monitoring the ciliary activity of the TOCs or by immunostaining. Only the titration of TOC supernatants harvested 6h p.i. showed some reduction in the amount of infectious virus. In contrast to chicken TOCs, the infection of turkey TOCs by the H9N2 virus was found to be neuraminidase-sensitive by all applied evaluation techniques. These findings suggest that avian influenza viruses use different receptors on their host cells depending on both the subtype of the hemagglutinin and the host species. Fluorescent staining using specific lectins to visualize α2,3 and α2,6-linked Sia on the cell surface revealed that both chicken and turkey respiratory epithelial cells contain α2,3-linked Sia, whereas α2,6-linked Sia were only found on the surface of the respiratory epithelium of turkey, but not of chicken. In order to enrich the number of tools for the detection of different Sia and Sia-linkage types, soluble HAs were generated and the binding properties were characterized. The construct H7Fc that was tagged with the Fc portion of the human IgG showed NA-sensitive binding to MDCK II cells and was also shown to recognize the apical epithelium of chicken TOCs. Therefore, soluble HAs might contribute greatly to the differentiation of Sia and enable a more detailed investigation of the receptor binding preferences of various influenza virus strains. In addition, the generation of soluble HAs represents a safe tool for the analysis of the receptor binding affinities of HPAI viruses without the BSL 3 facilities.

Die Infektion durch Influenza-Viren wird eingeleitet durch die Bindung des Hämagglutinins (HA) an Zelloberflächen-Glykoside mit terminalen Sialinsäuren (Sia). Es wird vermutet, dass die Verteilung von α2,3- und α2,6-gebundenen Sia auf den verschiedenen Zelltypen zusammen mit der Präferenz des Virus für diese Rezeptor-Determinante sowohl die Zell- als auch die Spezies-Spezifität des Virus bestimmen. In dieser Studie wurde die Infektion von Trachealring-Kulturen (TOCs) von Huhn und Pute durch aviäre Influenza Viren des H7 und H9 Subtyps charakterisiert. In TOCs bleibt die natürliche Zusammensetzung der Epithelzellen erhalten. Darüber hinaus ist eine Infektion durch ziliostatische Viren, wie Influenza Viren, durch Beobachtung der Zilien-Aktivität einfach zu detektieren. Um die Rolle der Sia beim Entstehen der Infektion zu untersuchen, wurden TOCs vor der Infektion mit Neuraminidase (NA) behandelt, um die Sia von der Zelloberfläche zu entfernen und die Zellen so vor einer Influenza Virus Infektion zu schützen. Der Effekt dieser NA-Vorbehandlung auf die Infektion wurde durch die Beobachtung der Zilienaktivität, sowie durch Immunfärbung von viralem Antigen und die Bestimmung der Menge infektiöser Viren im TOC-Überstand im frühen Verlauf der Infektion untersucht. Zusätzlich wurden die Zilien des Flimmerepithels angefärbt (anti-Tubulin), um mögliche Schädigungen der Epithelzellen sichtbar zu machen. Für die Infektion von Hühner- und Puten-TOCs durch ein H7N7 Virus war ein deutlicher, protektiver Effekt der NA-Vorbehandlung zu beobachten. Dieser Effekt äußerte sich in einer Verzögerung der Virus-induzierten Ziliostase, sowie in einer Reduzierung des detektierten Antigens 24h p.i. und des Titers infektiöser Viren im TOC-Überstand 9h p.i.. Die Tubulin-Färbung dieser TOCs zeigte eine starke Schädigung des Epithels 24h nach der Infektion unbehandelter TOCs, während in NA-vorbehandelten TOCs nur milde Schäden beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu wurde weder durch das Monitoring der Zilienaktivität, noch in der Immunfärbung ein Effekt der NA-Vorbehandlung auf die Infektion von Hühner-TOCs durch ein H9N2-Virus beobachtet. Nur die Titration von TOC-Überständen, die 6h p.i. genommen wurden, zeigte einen gewissen Abfall der Anzahl infektiöser Viren. Die Infektion von Puten-TOCs durch das H9N2 Virus zeigte jedoch in allen angewandten Evaluierungskriterien NA-Sensitivität. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung unterschiedlicher Rezeptoren auf der Wirtszelloberfläche durch aviäre Influenza Viren sowohl vom Virus-Subtyp, als auch von der Wirtsspezies abhängt. Fluoreszenzfärbungen unter Zuhilfenahme spezifischer Lektine zur Detektion von α2,3 und α2,6 gebundenen Sia zeigten, dass sowohl Hühner- als auch Puten-TOCs α2,3 gebundene Sia aufwiesen, während α2,6 gebundene Sia nur auf der Zelloberfläche des respiratorischen Puten-Epithels, nicht aber auf der apikalen Membran von Hühner-TOCs gefunden wurden. Um die Anzahl an Möglichkeiten der Sia-Detektion und –Unterscheidung zu verfeinern, wurden lösliche HA Konstrukte erstellt und deren Bindungseigenschaften charakterisiert. Das Fc-markierte H7Fc Konstrukt zeigte eine NA-sensitive Bindung an MDCK II Zellen und erkannte ebenfalls das apikale Epithel von Hühner-TOCs. Lösliche HAs könnten daher erheblich zur Unterscheidung verschiedener Sia und Sia-Bindungen beitragen und detailliertere Untersuchungen der Rezeptor-Präferenzen verschiedener Influenza-Virus-Stämme ermöglichen. Überdies bilden lösliche HAs ein sicheres Werkzeug, um die Rezeptorbindung hoch pathogener aviärer Influenza Viren ohne die Notwendigkeit eines Hochsicherheitslabors zu analysieren.

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Bohm, Maren Gertrud: The role of sialic acids in avian influenza virus infection of primary cell cultures. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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