Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

The influence of insulin-like growth factor 1 on in vivo oocyte developmental competence and in vitro preimplantation embryo development in cattle

Velazquez Cabrera, Miguel Abraham

The goal of the present thesis was to determine the effects of high concentrations of IGF1 on in vivo oocyte developmental competence and in vitro preimplantation embryo development in cattle. To evaluate the effects of high concentrations of IGF1 on in vitro preimplantation embryo development, in vitro-produced zygotes were either cultured in the absence or presence of physiological (100 ng/ml) or supraphysiological (1000 ng/ml) IGF1 concentrations. Cell allocation, occurrence of apoptosis, protein expression of the IGF1 receptor and TP53 gene, and transcript abundance of selected genes involved in apoptosis, glucose metabolism and the IGF system were analyzed in day-8 blastocysts. In vitro treatment with supraphysiological IGF1 concentrations was associated with the following outcomes: 1. No improvement in blastocyst formation. 2. Apoptosis levels were increased. 3. Decreased TP53 protein expression in the trophectoderm (TE). 4. Increased number of cells in the inner cell mass (ICM). 5. Increased IGF1 receptor (IGF1R) protein expression in the ICM. 6. A significant percentage of blastocysts (15.1 %) showed a high ICM/Total cell number proportion not observed in controls and virtually absent (1.3 %) in embryos treated with physiological concentrations of IGF1. In vitro treatment with physiological IGF1 concentrations was associated with the following outcomes: 1.- Increased blastocyst formation with no effect on cell number or apoptosis levels. 2.- Up-regulated transcript expression of IGF binding protein 3 (IGFBP3). 3.- Increased IGF1R protein expression To evaluate the effects of high concentration of IGF1 on in vivo oocyte developmental competence superovulated lean lactating and obese non-lactating dairy cows received intraovarian injections of 1 µg of IGF1. This amount of IGF1 is similar to the concentration suggested to be present in women with the polycystic ovary syndrome (PCOS) experiencing early pregnancy loss and has been associated with detrimental effects on bovine oocyte competence in vitro. Transcript abundance and protein expression of genes related to the IGF system and involved in apoptosis and glucose metabolism were evaluated in blastocyst collected 8 days after first artificial insemination. In addition, concentration of IGF1 in plasma and uterine luminal fluid (ULF) were measured on day of embryo collection. After intraovarian application of IGF1 the following outcomes were observed: 1.- Decreased in both the number and proportion of viable embryos in lean cows to levels observed in obese cows. 2.- No affect on the superovulatory response of obese cows. 3.- Increased blastocyst transcript abundance of SLC2A1 and IGFBP3 in lean cows 4.- Reduced blastocyst protein expression of TP53 in lean cows 5.- Increased blastocyst protein expression of TP53 in obese cows. This in vivo model revealed a correlation between plasma and ULF concentrations of IGF1 only in the control groups. Blastocyst transcript abundance of IGF1R and IGFBP3 correlated positively with concentrations of IGF1 in both plasma and ULF, albeit only in control lean cows. This latter group also showed the highest yield of viable embryos and the lowest rate of embryo degeneration. The detrimental microenvironment created by the intraovarian IGF1 injection in lean cows and the lack of effect in obese cows in the present superovulated bovine model, resembles to a certain extend the situation observed in PCOS, where IGF1 bioavailability is increased in normal-weight PCOS women but reduced in obese PCOS patients. Results from the present investigation strongly indicate that high IGF1 concentrations are detrimental to the establishment of pregnancy, even after a short exposure. This information is not only relevant for PCOS women, but also for individuals using growth hormone, IGF1, or bovine colostrum as means to improve physical performance.

Das Ziel diese Dissertationsarbeit war es, den Einfluss von hohen IGF1-Konzentrationen auf die Entwicklungskompetenz von Rinderoozyten in vivo und die Entwicklung von präimplantatorischen Rinderembryonen in vitro zu untersuchen. Um die Effekte hoher IGF1-Konzentrationen während der in vitro-Kultur von präimplantatorischen Rinderembryonen zu ermitteln, wurden in vitro-produzierte Zygoten ohne IGF1, mit einer physiologischen (100 ng/ml) oder mit einer supraphysiologischen IGF1-Konzentration kultiviert. In Tag 8-Blastozysten wurden Zellallokation, Apoptose, Proteinexpression von IGF1-Rezeptor und TP53 und die Transkript-Gehalte von ausgewählten Genen, die an der Regulation von Apoptose, Glukose-Metabolismus und der IGF-Signaltransduktionskette beteiligt sind, bestimmt. Nach in vitro-Behandlung präimplantatorischer Rinderembryonen mit supraphysiologischen IGF-1-Konzentrationen wurden folgende Befunde erhoben: 1. Die Blastozystenrate war nicht verändert. 2. Die Apoptoserate war erhöht. 3. Die TP53-Protein-Expression im Trophektoderm war verringert. 4. Die Zellzahl der Inner cell mass (ICM)-Zellen war erhöht. 5. Die IGF1-Rezeptor-Expression war in der ICM erhöht. 6. Ein signifikanter Anteil von Blastozysten (15,1%) wies ein hohes Verhältnis von ICM-  Zellen zur Gesamtzellzahl auf; dieser Effekt wurde in den Kontrollen nicht beobachtet und trat bei Embryonen, die mit physiologischen IGF1-Konzentrationen behandelt wurden, wesentlich seltener auf (1.3%). Nach in vitro-Behandlung präimplantatorischer Rinderembryonen mit physiologischen IGF1-Konzentrationen wurden folgende Befunde erhoben: 1. Die Blastozystenrate war erhöht, ohne dass Effekte im Hinblick auf Zellzahlen oder Apoptose gemessen wurden. 2. Die Transkriptgehalte von IGF-bindendem Protein-3 (IGFBP3) waren erhöht. 3. Die IGF1R-Protein-Expression war erhöht. Um die Auswirkungen von hohen IGF1-Konzentrationen auf die in vivo-Oozyten-Entwicklung zu ermitteln, wurden superovulierte normalgewichtige, laktierende, sowie übergewichtige, nicht-laktierende Milchkühe mit intraovariellen Injektionen von IGF1 (1 mg) behandelt. Diese Menge von IGF1 resultiert in Gewebekonzentrationen von IGF1, die wahrscheinlich denen entsprechen, die in Frauen, die an dem Polycystischen Ovarsyndrom (PCOS) leiden, vorkommen. Bei PCOS-Patienten tritt häufig ein früher Abort auf, diese Symptome wurden mit nachteiligen Auswirkungen von IGF1 auf die bovine Oozytenreifungskompetenz assoziert. Die Transkriptgehalte und die Proteinexpression von Genen, die in der IGF1-Signaltransduktion, der Apoptose und dem Glukosemetabolismus beteiligt sind, wurden in Blastozyten ermittelt, die 8 Tage nach künstlicher Befruchtung gespült wurden. Zusätzlich wurden die Konzentrationen von IGF1 im Plasma und der uterinen Luminalflüssigkeit (ULF) am Tag der Embryospülung gemessen. Nach intraovarieller IGF1-Injektion wurden folgende Befunde erhoben: 1. Die absolute und relative Anzahl von lebensfähigen Embryonen aus normalgewichtigen Kühen war auf die Ergebnisse aus übergewichtigen Kühen reduziert. 2. Die Superovulationsantwort in übergewichtigen Kühen war unverändert. 3. Die Transkriptgehalte von SLC2A1 und IGFBP3 waren in Blastozysten aus normalgewichtigen Kühen erhöht. 4. Die TP53-Protein-Expression war in Blastozysten aus normalgewichtigen Kühen reduziert. 5. Die TP53-Protein-Expression war in Blastozysten aus übergewichtigen Kühen erhöht. Nur in den Kontrollgruppen zeigte das in vivo-Model eine Korrelation zwischen den IGF1-Konzentrationen in Plasma und ULF. Ebenso zeigte nur die normalgewichtige Kontrollgruppe eine positive Korrelation der IGF1R und IGFBP3-Transkriptgehalte in Blastozysten mit den IGF1-Konzentrationen in Plasma und ULF. In der Kontrollgruppe ergab sich auch die höchste Ausbeute vitaler Embryonen und entsprechend die geringste Rate an degenerierten Embryonen. Die nachteilige Mikroumgebung in Bezug auf Embryoentwicklung nach intraovarieller IGF1-Injektion in normalgewichtigen Kühen und das Fehlen von Effekten in übergewichtigen Kühen, ähneln bis zu einem gewissen Grad der Situation in PCOS-Patienten, bei denen die IGF1-Bioverfügbarkeit bei Normalgewichtigen erhöht, aber bei Übergewichtigen erniedrigt ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen deutlich darauf hin, dass sich hohe IGF1-Konzentrationen, selbst bei kurzer Expositionszeit, nachteilig auf die Etablierung einer Trächtigkeit bei Rindern auswirken. Dieser Befund kann nicht nur für PCOS-Patienten, sondern auch für Individuen relevant sein, die Wachstumshormon, IGF1, oder bovines Kolostrum zur Erhöhung ihrer physischen Leistung nutzen.

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Velazquez Cabrera, Miguel Abraham: The influence of insulin-like growth factor 1 on in vivo oocyte developmental competence and in vitro preimplantation embryo development in cattle. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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