Nitric oxide mediated signal transduction in networks of human model neurons

Das komplexe Zentralnervensystem (ZNS) der Mammalia durchläuft aufeinander folgende, zum Teil auch sich überlagernde, zelluläre Entwicklungsprozesse, zu denen Zellproliferation, Migration, Differenzierung und Synaptogenese gehören. Der gasförmige Botenstoff Stickstoffmonoxid (NO) ist mit der Regulation jeder dieser frühen neuronalen Entwicklungsprozesse in Zusammenhang gebracht worden. Allerdings ist noch nicht bekannt, ob eine NO Signalübertragung an der Entwicklung des humanen ZNS beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit habe ich humane neuronale Stammzellen als Modell für Nervenzellen in der Entwicklung verwendet, um die potentielle Rolle der NO-Signalisierung während der neuronalen Migration, Differenzierung und der präsynaptischen Vesikel Entleerung zu untersuchen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell für humane neuronale Vorläufer Zellen aus embryonalen Karzinom Stammzellen (NT2) als dreidimensionale, frei flottierende Zellaggregat-Kultur etabliert. Durch die Behandlung mit Retinsäure generieren die sphärischen NT2-Aggregate Zellen, die proliferieren, migrieren und sich zu neuronalen Phänotypen differenzieren. Dies imitiert zelluläre Prozesse, die während der frühen Entwicklung des ZNS ablaufen. Interessanterweise sprechen die migrierenden Zellen und die Zellen innerhalb der Sphären auf exogene Stimulierung mit NO an, indem sie zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) synthetisieren. Dies deutet darauf hin, dass die kugeligen NT2-Aggregate eine funktionale NO/cGMP-Signalübertragung aufweisen. Unter Verwendung von kleinen, bioaktiven Enzymaktivatoren und -inhibitoren der neuronalen Stickstoffmonoxid Synthase (nNOS), der löslichen Guanylyl Zyklase (sGC) und der Proteinkinase G (PKG) zeigte ich, daß die NO/cGMP/PKG-Signalkaskade ein positiver Regulator für die Migration humaner neuronaler Vorläuferzellen ist. Desweiteren konnte ein anti-proliferativer Effekt von NO bei relativ höheren Konzentrationen des NO-Donors beobachtet werden. Außerdem war ein leichter, jedoch nicht signifikanter Effekt der NO/cGMP-Signalisierung auf die neuronale Differenzierung zu bemerken. Im zweiten Teil wurde die präsynaptische Reifung der humanen NT2-Neurone verfolgt, nachdem diese aus den spärischen NT2-Aggregaten migriert sind und neuronale Netzwerke geformt haben. Humane NT2-Neurone exprimieren ansteigende Spiegel eines axonalen Markers (Tau) und typische präsynaptische Proteine (Synapsin und Synaptotagmin I), abhängig von der Dauer der in vitro Kultur. Unter Verwendung eines Antikörpers der gegen die luminale Domäne von Synaptotagmin I gerichtet ist und einem Fluoreszenzfarbstoff (FM1-43) zeigte ich, daß depolarisierte ausgereifte NT2-Neurone ein Calcium-abhängiges, exo-endozytotisches Recycling der synaptischen Vesikel aufweisen. NT2-Neurone expremieren nNOS und einen funktionalen NO-Rezeptor, sGC. Als nächstes untersuchte ich, ob die NO Signaltransduktion den Turnover der synaptischen Vesikel moduliert. Dieser Signalweg könnte zur aktivitätsabhängigen synaptischen Reifung in humanen Modellneuronen beitragen. Zwei NO-Donoren (Natriumnitroprussid und N-Ethyl-2-(1-ethyl-2-hydroxy-2-nitrosohydrazino ethanamine)) und ein cGMP-Analogon (8-Br-cGMP) förderten den synaptischen Vesikel Turnover, während ein sGC-Inhibitor den NO-Donor Effekt blockierte. NO-Donoren riefen eine Vesikel Exozytose hervor, die teilweise durch den sGC-Inhibitor blockiert wurde. Forskolin, ein Aktivator der Adenylyl Zyklase, und ein cAMP-Analogon induzierten ein Recycling von synaptischen Vesikeln und Exozytose über einen parallel agierenden Proteinkinase A-Signalweg. Diese Ergebnisse deuten an, daß die NO/zyklisches Nukleotid-Signalwege die präsynaptische Neurotransmitter Ausschüttung im humanen Gehirn fördern könnten. Schließlich habe ich das Vorkommen und die Funktion einer NO/cGMP-Signalübertragung in fötalen humanen neuronalen Vorläuferzellen (hNPCs) überprüft. Fötale hNPCs wurden als dreidimensionale Neurosphären kultiviert, welche proliferieren, migrieren und zu neuronalen und glialen Zellen differenzieren. Die migrierenden Zellen aus humanen Neurosphären exprimieren funktionale sGCs, welche durch Aktivierung mit NO ansteigende cGMP-Spiegel synthetisieren. Die Zugabe von Enzym-Inhibitoren von sGC oder PKG blockierten die Zellmigration aus den humanen Neurosphären. Die Inhibierung der sGC konnte durch ein membranpermeables cGMP-Analogon aufgehoben werden. Sowohl ein NO-Donor, als auch ein cGMP-Analogon förderte die Zellmigration in gain-of-function Experimenten, was nahelegt, daß eine NO-cGMP-Signalübertragung die Migration von hNPCs positiv reguliert. Diese Ergebnisse liefern die ersten experimentellen Beweise für eine Rolle der NO/cGMP-Signaltransduktion als ein Regulator für die Zellmigration während der frühen Entwicklung des humanen Gehirns.