Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Nitric oxide mediated signal transduction in networks of human model neurons

Tegenge, Million Adane

The complex mammalian central nervous system (CNS) undergoes sequential but partially overlapping cellular developmental processes that include cell proliferation, migration, differentiation and synaptogenesis. The gaseous messenger nitric oxide (NO) has been implicated to regulate each of these early neuronal developmental processes. However, it is not known whether NO signaling is involved in the development of human CNS. Here, I used human neuronal stem cells as a model of developing nerve cells to investigate the potential role of NO signaling in neuronal migration, differentiation and pre-synaptic vesicle release. In the first part, a model of human neuronal precursor cells was established from embryonic carcinoma stem cells (NT2 cells) as three-dimensional free-floating aggregate culture. Upon retinoic acid treatment the NT2 spherical aggregates generate cells that proliferate, migrate and differentiate into neuronal phenotypes which mimic cellular processes that occur during early development of CNS.  Interestingly, the migrating cells and cells inside the spheres respond to exogenous stimulation with NO by synthesizing cyclic guanosine-monophosphate (cGMP), indicating that the NT2 spherical aggregates express functional NO/cGMP signaling. By employing small bioactive enzyme activators and inhibitors of neuronal nitric oxide synthase (nNOS), soluble guanylyl cyclase (sGC) and protein kinase G (PKG), I showed that the NO/cGMP/PKG signaling cascade is a positive regulator of the migration of human neuronal precursor cells. Moreover, anti-proliferative effect of NO was observed at relatively higher concentration of a NO donor. A modest but none significant effect of NO/cGMP signaling on neuronal differentiation was also noted. In the second part, pre-synaptic maturation of human NT2 neurons were followed after the cells migrate out of NT2 spherical aggregates and form neuronal networks. Human NT2 neurons express increasing levels of the axonal marker (Tau) and typical pre-synaptic proteins (synapsin and synaptotagmin I) depending on the length of in vitro culture. By employing an antibody directed against the luminal domain of synaptotagmin I and the fluorescent dye (FM1-43), I showed that depolarized mature NT2 neurons display calcium-dependent exo-endocytotic synaptic vesicle recycling. NT2 neurons express nNOS and a functional NO receptor, sGC. Next, I examined whether NO signal transduction modulates synaptic vesicle turnover, a pathway that may contribute to activity dependent synaptic maturation in human model neurons. Two NO donors (sodium nitroprusside, and N-Ethyl-2-(1-ethyl-2-hydroxy-2-nitrosohydrazino ethanamine)) and cGMP analog (8-Br-cGMP) enhanced synaptic vesicle turnover while a sGC inhibitor blocked the effect of NO donors. NO donors evoked vesicle exocytosis which was partially blocked by the sGC inhibitor. The activator of adenylyl cyclase, forskolin, and a cAMP analog induced synaptic vesicle recycling and exocytosis via a parallel acting protein kinase A pathway. These data suggest that NO/cyclic nucleotide signaling pathways may facilitate pre-synaptic neurotransmitter release in human brain. Finally, I tested the presence and function of NO/cGMP signaling in fetal human neural progenitor cells (hNPCs). Fetal hNPCs were cultured as three-dimensional neurospheres that proliferate, migrate and differentiate into both neuronal and glial cells. The migrating cells from human neurosphere express functional sGC that synthesize increasing level of cGMP upon activation with NO.  Application of enzyme inhibitors of sGC and PKG blocked the migration of cells out of human neurospheres. Inhibition of sGC can be rescued by a membrane permeable analog of cGMP. In gain of function experiments both NO donor and cGMP analog facilitate cell migration suggesting that NO-cGMP signaling positively regulates hNPCs migration. These results provide first experimental evidence for a role of NO/cGMP signal transduction as a regulator of cell migration during early development of the human brain.

Das komplexe Zentralnervensystem (ZNS) der Mammalia durchläuft aufeinander folgende, zum Teil auch sich überlagernde, zelluläre Entwicklungsprozesse, zu denen Zellproliferation, Migration, Differenzierung und Synaptogenese gehören. Der gasförmige Botenstoff Stickstoffmonoxid (NO) ist mit der Regulation jeder dieser frühen neuronalen Entwicklungsprozesse in Zusammenhang gebracht worden. Allerdings ist noch nicht bekannt, ob eine NO Signalübertragung an der Entwicklung des humanen ZNS beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit habe ich humane neuronale Stammzellen als Modell für Nervenzellen in der Entwicklung verwendet, um die potentielle Rolle der NO-Signalisierung während der neuronalen Migration, Differenzierung und der präsynaptischen Vesikel Entleerung zu untersuchen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell für humane neuronale Vorläufer Zellen aus embryonalen Karzinom Stammzellen (NT2) als dreidimensionale, frei flottierende Zellaggregat-Kultur etabliert. Durch die Behandlung mit Retinsäure generieren die sphärischen NT2-Aggregate Zellen, die proliferieren, migrieren und sich zu neuronalen Phänotypen differenzieren. Dies imitiert zelluläre Prozesse, die während der frühen Entwicklung des ZNS ablaufen. Interessanterweise sprechen die migrierenden Zellen und die Zellen innerhalb der Sphären auf exogene Stimulierung mit NO an, indem sie zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) synthetisieren. Dies deutet darauf hin, dass die kugeligen NT2-Aggregate eine funktionale NO/cGMP-Signalübertragung aufweisen. Unter Verwendung von kleinen, bioaktiven Enzymaktivatoren und -inhibitoren der neuronalen Stickstoffmonoxid Synthase (nNOS), der löslichen Guanylyl Zyklase (sGC) und der Proteinkinase G (PKG) zeigte ich, daß die NO/cGMP/PKG-Signalkaskade ein positiver Regulator für die Migration humaner neuronaler Vorläuferzellen ist. Desweiteren konnte ein anti-proliferativer Effekt von NO bei relativ höheren Konzentrationen des NO-Donors beobachtet werden. Außerdem war ein leichter, jedoch nicht signifikanter Effekt der NO/cGMP-Signalisierung auf die neuronale Differenzierung zu bemerken. Im zweiten Teil wurde die präsynaptische Reifung der humanen NT2-Neurone verfolgt, nachdem diese aus den spärischen NT2-Aggregaten migriert sind und neuronale Netzwerke geformt haben. Humane NT2-Neurone exprimieren ansteigende Spiegel eines axonalen Markers (Tau) und typische präsynaptische Proteine (Synapsin und Synaptotagmin I), abhängig von der Dauer der in vitro Kultur. Unter Verwendung eines Antikörpers der gegen die luminale Domäne von Synaptotagmin I gerichtet ist und einem Fluoreszenzfarbstoff (FM1-43) zeigte ich, daß depolarisierte ausgereifte NT2-Neurone ein Calcium-abhängiges, exo-endozytotisches Recycling der synaptischen Vesikel aufweisen. NT2-Neurone expremieren nNOS und einen funktionalen NO-Rezeptor, sGC. Als nächstes untersuchte ich, ob die NO Signaltransduktion den Turnover der synaptischen Vesikel moduliert. Dieser Signalweg könnte zur aktivitätsabhängigen synaptischen Reifung in humanen Modellneuronen beitragen. Zwei NO-Donoren (Natriumnitroprussid und N-Ethyl-2-(1-ethyl-2-hydroxy-2-nitrosohydrazino ethanamine)) und ein cGMP-Analogon (8-Br-cGMP) förderten den synaptischen Vesikel Turnover, während ein sGC-Inhibitor den NO-Donor Effekt blockierte. NO-Donoren riefen eine Vesikel Exozytose hervor, die teilweise durch den sGC-Inhibitor blockiert wurde. Forskolin, ein Aktivator der Adenylyl Zyklase, und ein cAMP-Analogon induzierten ein Recycling von synaptischen Vesikeln und Exozytose über einen parallel agierenden Proteinkinase A-Signalweg. Diese Ergebnisse deuten an, daß die NO/zyklisches Nukleotid-Signalwege die präsynaptische Neurotransmitter Ausschüttung im humanen Gehirn fördern könnten. Schließlich habe ich das Vorkommen und die Funktion einer NO/cGMP-Signalübertragung in fötalen humanen neuronalen Vorläuferzellen (hNPCs) überprüft. Fötale hNPCs wurden als dreidimensionale Neurosphären kultiviert, welche proliferieren, migrieren und zu neuronalen und glialen Zellen differenzieren. Die migrierenden Zellen aus humanen Neurosphären exprimieren funktionale sGCs, welche durch Aktivierung mit NO ansteigende cGMP-Spiegel synthetisieren. Die Zugabe von Enzym-Inhibitoren von sGC oder PKG blockierten die Zellmigration aus den humanen Neurosphären. Die Inhibierung der sGC konnte durch ein membranpermeables cGMP-Analogon aufgehoben werden. Sowohl ein NO-Donor, als auch ein cGMP-Analogon förderte die Zellmigration in gain-of-function Experimenten, was nahelegt, daß eine NO-cGMP-Signalübertragung die Migration von hNPCs positiv reguliert. Diese Ergebnisse liefern die ersten experimentellen Beweise für eine Rolle der NO/cGMP-Signaltransduktion als ein Regulator für die Zellmigration während der frühen Entwicklung des humanen Gehirns.

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Tegenge, Million Adane: Nitric oxide mediated signal transduction in networks of human model neurons. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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