Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung des Hauptsuszeptibilitätslocus Cdcs1 für experimentelle, chronisch entzündliche Darmerkrankungen

Büchler, Gwen

Inflammatory bowel diseases (IBD) result from an excessive immune response in a genetically susceptible host caused by a combination of immunological and environmental factors. The IL10-deficient (Il10tm1Cgn, Il10-/-) mouse serves as a model for experimental IBD; in this model system the C3H/HeJBir.129P2/JZtm (C3Bir)-Il10-/- strain is highly susceptible to typhlocolitis while C57BL/6J.129P2/JZtm (B6)-Il10-/- mice show a relatively resistant phenotype. Genetic analysis using segregating backcross and F2-populations of the two parental strains revealed that cytokine deficiency induced colitis susceptibility (Cdcs) 1 on MMU3 is a major colitogenic locus. Transfer of the Cdcs1 haplotype between the parental strains resulted in congenic Il10-/- mice that followed the phenotype of the donor strain of Cdcs1. The aim of this study was to characterize Cdcs1 by genetical and phenotypical analysis to identify factors potentially causing the disparate susceptibility. Histological determination of the phenotype of selected congenic strains along with finemapping of the Cdcs1 region in these strains revealed that Cdcs1 contains three independent regions: Cdcs1.1 (88.1 to 108.8 Mbp), Cdcs1.2 (120.0 to 123.0 Mbp), and Cdcs1.3 (125.6 to 128.0 Mbp). Within these intervals, 55 genes were identified that contain polymorphisms in their amino acid sequence or in possible regulatory regions between the strains B6 and C3H/HeJ. Moreover, four candidate genes (Fcgr1, Cnn3, Larp7 and Alpk1) displayed different expression profiles in the two parental strains as shown in separate studies performed in a collaborative approach. Phenotypical analyses demonstrated no influence of the C3Bir haplotype of Cdcs1 on TNF secretion of macrophages derived from the bone marrow or the peritoneum and stimulated with PGN or CpG. Additionally, mice of the B6-Il10-/-, C3Bir-Il10-/- and the congenic BC-R3-Il10-/- strains were infected with Helicobacter (H.) hepaticus and the severity of typhlocolitis was graded after 4 (acute inflammation) or 13 weeks (chronic inflammation) of infection. This infection did not completely reproduce the inflammatory response of the original colitogenic flora of the not rederived mouse colony. Nevertheless, a proinflammatory effect was observed in the cecum caused by the C3Bir haplotype of Cdcs1. Furthermore, this Cdcs1 haplotype inhibited the development of rectal prolapses that otherwise occurred in infected B6-Il10-/- mice. After chronic H. hepaticus infection, the secretion of eleven cytokines typically involved in Th1/Th2 immune responses was measured in anti-CD3 stimulated mesenteric lymph node cells. The C3Bir haplotype of Cdcs1 was associated with a significantly increased IL17 and IFN-γ secretion compared to the B6-Il10-/- haplotype. Taking into account that these cytokines play a predominant role in various inflammatory processes, e.g. in IBD of Il10-/- mice, it makes it likely that the Cdcs1 haplotype of C3Bir mice mediates an excessive adaptive immune response. The possible role of host genetics on compositional changes of microflora during H.hepaticus induced inflammation was investigated in chronically infected mice. Using T-RFLP analysis, the species richness, diversity and the composition of the microbiota were determined in cecum, colon and feces. H. hepaticus induced inflammation caused a reduction of both species richness and diversity and considerably changed the composition of the cecal and colonic microbiota in a strain dependent manner. In addition species richness and diversity decreased more in infected C3Bir-Il10-/- mice than in B6-Il10-/- mice, suggesting an association between changes in microbiota and disease susceptibility. In conclusion, the major susceptibility locus Cdcs1 is characterized by a complex interaction of at least three genetic factors, it mediates susceptibility to Il10-/- associated IBD as well as to experimental H. hepaticus infection, and it most likely affects adaptive immune responses. Furthermore, strain specific alterations of microflora composition might influence susceptibility to disease. Therefore, the present model reflects the human situation well and identification of the genes and the mechanisms that underlie Cdcs1-mediated susceptibility might help identify new therapeutic approaches for human IBD.

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) entwickeln sich aufgrund einer unkontrollierten Immunantwort, die in einem genetisch prädisponierten Individuum durch eine Kombination von immunologischen und umweltbedingten Faktoren ausgelöst wird. Die IL10-defiziente Maus (Il10tm1Cgn, Il10-/-) dient als Tiermodell für CED. In diesem Modell zeigen Il10-/--Mäuse des C57BL/6J (B6) -Stammes lediglich eine leichte Typhlokolitis, während Mäuse des C3H/HeJBir.129P2/JZtm (C3Bir) -Il10-/--Stammes sehr starke Darmentzündungen entwickeln. Im Rahmen von genetischen Untersuchungen wurde der Suszeptibilitätslocus Cdcs1 auf MMU3 identifiziert, der die unterschiedliche Ausprägung der Darmentzündung in diesem Tiermodell maßgeblich beeinflusst. Dieses wurde durch kongene Il10-/--Mäuse bestätigt, bei denen der Cdcs1-Haplotyp zwischen dem suszeptiblen und dem resistenten Il10-/--Stamm transferiert wurde. Das Ziel dieser Studie war es, Cdcs1 durch genetische und phänotypische Analysen näher zu charakterisieren, um mögliche Faktoren der unterschiedlichen Suszeptibilität zu identifizieren. Durch histologische Untersuchungen und Feinkartierung der Cdcs1-Region in ausgewählten kongenen Mäusen konnte gezeigt werden, dass sich der Cdcs1 Locus in die drei unabhängigen Teilbereiche Cdcs1.1 (88,1 bis 108,8 Mbp), Cdcs1.2 (120,0 bis 123,0 Mbp) und Cdcs1.3 (125,6 bis 128,0 Mbp) aufgliedert. Innerhalb dieser Bereiche wurden 55 Kandidatengene identifiziert, die Unterschiede in der Aminosäuresequenz oder in möglichen regulatorischen Regionen zwischen B6- und C3H/HeJ-Mäusen aufweisen. Von diesen sind die vier Gene Fcgr1, Cnn3, Larp7 und Alpk1 hervorzuheben, da sie zusätzlich in unabhängigen Expressionsstudien Unterschiede zwischen den Parentalstämmen zeigten. Im Rahmen der phänotypischen Untersuchung konnte kein Einfluss des Cdcs1-Haplotyps der C3Bir-Mäuse auf die TNF Sekretion von PGN- oder CpG-stimulierten Peritoneal- und Knochenmarksmakrophagen nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden mit Helicobacter (H.) hepaticus infizierte Mäuse der Stämme B6-Il10-/-und C3Bir-Il10-/-sowie eines kongenen Stammes (BC-R3-Il10-/-) nach 4 Wochen (akute Entzündung) und nach 13 Wochen (chronische Entzündung) bezüglich der Schwere der Typhlokolitis untersucht. Zu keinem Zeitpunkt wurde die oben beschriebene Suszeptibilität der Mausstämme, wie sie in der ursprünglichen Haltung mit einer kolitogenen Darmflora auftrat, vollständig reproduziert. Allerdings wurde ein auf das Zäkum begrenzter entzündungsfördernder Effekt des Cdcs1-Haplotyps der C3Bir-Mäuse dokumentiert. Weiterhin verhinderte dieser Cdcs1-Haplotyp die Entwicklung eines Rektumprolapses, der bei H. hepaticus infizierten Mäusen des B6-Il10-/- Parentalstamms auftrat. Überdies wurde die Sekretion von elf Zytokinen, die vorwiegend in der Th1-/Th2-Immunantwort von Bedeutung sind, in anti-CD3 stimulierten Lymphknotenzellen der chronisch infizierten Mäuse überprüft. Die Zellen mit einem Cdcs1-Haplotypen der C3Bir-Il10-/--Mäuse setzten signifikant mehr IL17 und IFN-γ frei als die Zellen der B6-Il10-/--Mäuse. Die Sekretion dieser Zytokine ist charakteristisch für verschiedene chronische Entzündungsprozesse, u.a. die Darmentzündung in dem vorliegenden Tiermodell. Damit scheint der Cdcs1-Haplotyp der C3Bir Mäuse mit einer Überreaktion des spezifischen Immunsystems assoziiert zu sein. Weiterhin wurde in dem chronischen Infektionsmodell ein möglicher genetischer Effekt der Stämme B6-Il10-/-und C3Bir-Il10-/-auf die Zusammensetzung der Mikrobiota in Zäkum, Kolon und Kot während der H. hepaticus induzierten Darmentzündung überprüft. Hierbei wurde die Bakteriengemeinschaft anhand einer T-RFLP-Analyse charakterisiert und Parameter des Artenreichtums, der Artendiversität und Veränderungen in der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft bestimmt. Insgesamt bewirkte die H. hepaticus-induzierte Entzündung eine Reduktion des Artenreichtums und der -diversität sowie eine deutliche Veränderung der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft von Zäkum und Kolon. Darüber hinaus zeigten die infizierten C3Bir-Il10-/--Mäuse eine stärkere Beeinflussung des Artenreichtums und der -diversität der intestinalen Mikrobiota als die B6-Il10-/--Mäuse, was im Zusammenhang mit der vermehrten Suszeptibilität der C3Bir-Il10-/--Mäuse stehen könnte. Der komplexe CED-Suszeptibilitätslocus Cdcs1 wird von mindestens drei genetischen Faktoren bestimmt, welche die Ausprägung der Il10-/-mediierten Darmentzündung, die Auswirkung einer experimentellen H. hepaticus Infektion und die Th1/Th17 vermittelte Immunantwort der Mäuse beeinflussen. Weiterhin könnten Mausstamm-spezifische Alterationen der intestinalen Mikrobiota einen Einfluss auf die Ausprägung der Darmentzündung haben. Damit weist dieses Modell deutliche Parallelen zu der humanen Erkrankung auf; insbesondere die Identifikation der genetischen Faktoren und der genauen Mechanismen, die dem Cdcs1-Locus zugrundeliegen, könnte Ansatzpunkte für neue therapeutische Interventionen bei CED bieten.

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Büchler, Gwen: Charakterisierung des Hauptsuszeptibilitätslocus Cdcs1 für experimentelle, chronisch entzündliche Darmerkrankungen. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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